临床研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2007. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2007-04-18; 15(11): 1232-1236
在线出版日期: 2007-04-18. doi: 10.11569/wcjd.v15.i11.1232
自体树突状细胞联合抗病毒治疗对HBV慢性感染者的临床效应
佟立新, 刘树贤, 郭力红, 段卫, 陈白丽, 王海舫, 柳立平, 申伟, 王淑云
佟立新, 刘树贤, 郭力红, 段卫, 陈白丽, 王海舫, 柳立平, 申伟, 王淑云, 河北医科大学第一医院肝病中心 河北省石家庄市 050031
佟立新, 医学学士, 主任医师, 主要从事肝病临床治疗研究.
基金项目: 河北省科技厅资助项目, No. 04276101D-40.
通讯作者: 刘树贤, 050031, 河北省石家庄市东岗路89号, 河北医科大学第一医院肝病中心. lzhaoy-002@163.com
电话: 0311-85917156
收稿日期: 2006-12-06
修回日期: 2007-01-05
接受日期: 2007-01-10
在线出版日期: 2007-04-18

目的: 观察乙肝病毒(HBV)慢性感染者自体树突状细胞(DC)联合抗病毒治疗的临床效应.

方法: 采用自身前后对照试验, 对41例HBV慢性感染者在试验前均应用IFN-α-2b治疗6 mo, 无应答者停药6 mo后继续IFN-α-2b治疗6 mo, 同时联合自体DC回输治疗, 回输两次为一疗程. 疗程结束后1 mo检测受试者病毒学、血清学、生化学指标, 在回输前后起始的检测指标均一致的基础上观察自身前后的变化.

结果: 体外培养扩增DC至第6天, HBsAg致敏形成特异性DC疫苗. DC回输后ALT和AST水平较回输前明显降低(t = 2.976, P<0.01; t = 2.049, P<0.05). HBV DNA应答率为53.7%, DNA拷贝数下降≥2log10. DC回输次数与病毒学应答反应没有相关性(r = 0.048, P>0.05), HBV携带时间与病毒学应答反应亦没有相关性(r = 0.137, P>0.05).

结论: 自体DC回输联合IFN-α-2b治疗HBV慢性感染者, 生化学和病毒学单项应答反应均优于单纯IFN-α-2b治疗.

关键词: 树突状细胞; 乙型肝炎病毒; 联合治疗; 抗病毒

引文著录: 佟立新, 刘树贤, 郭力红, 段卫, 陈白丽, 王海舫, 柳立平, 申伟, 王淑云. 自体树突状细胞联合抗病毒治疗对HBV慢性感染者的临床效应. 世界华人消化杂志 2007; 15(11): 1232-1236
Clinical effects of autologous dendritic cells combined with anti-virus therapy on chronic hepatitis B virus infection
Li-Xin Tong, Shu-Xian Liu, Li-Hong Guo, Wei Duan, Bai-Li Chen, Hai-Fang Wang, Li-Ping Liu, Wei Shen, Shu-Yun Wang
Li-Xin Tong, Shu-Xian Liu, Li-Hong Guo, Wei Duan, Bai-Li Chen, Hai-Fang Wang, Li-Ping Liu, Wei Shen, Shu-Yun Wang, Center of Liver Diseases, the First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
Supported by: the Grants from Hebei Science and Technology Bureau, No. 04276101D-40.
Correspondence to: Dr. Shu-Xian Liu, Center of Liver Diseases, the First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, 89 Donggang Road, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China. lzhaoy-002@163.com
Received: December 6, 2006
Revised: January 5, 2007
Accepted: January 10, 2007
Published online: April 18, 2007

AIM: To evaluate the clinical effects of autologous HBsAg-loaded dendritic cells (DCs) combined with anti-viral treatment on patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection.

METHODS: A total of 41 chronic HBV infected subjects were treated with single interferon-α-2b for 6 mo before the trial, and the treatment was stopped for the irresponsive cases. Six months later, the irresponsive cases received the combined therapy of interferon-α-2b and autologous HBsAg-loaded DCs for another 6 mo (one course containing twice of re-transfusion). The changes of virology, serology and biochemistry indexes were observed one month after the end of treatment.

RESULTS: DCs were cultured in vitro. After proliferation for 6 d, DCs were incubated with HBsAg for 1 d to prepare the specific DCs vaccine. The levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were significant decreased after the combined therapy as compared with those before (t = 2.976, P < 0.01; t = 2.049, P < 0.05). The response rate of HBV DNA was 53.7%, and the decrease of HBV DNA copies was greater than or equal to 2log10. Neither the injection times of DCs nor the HBV-carrying time had a correlation with the virological responses (r = 0.048, P > 0.05; r = 0.137, P > 0.05).

CONCLUSION: Combined treatment of autologous DCs vaccine and interferon-α-2b has a favorable effect on patients with chronic HBV infection.

Key Words: Dendritic cell; Hepatitis B virus; Combined treatment; Anti-virus


0 引言

自1990年代初至今, 随着对树突状细胞(DC)的体外分离、扩增和培养技术方面的基础研究, 带动了临床研究的逐渐深入. 目前已发现了许多疾病的发生与转归都与DC有关. 因此通过对DC成熟过程中的改变来调节机体的免疫功能, 渴望达到治疗疾病的目的已成了研究的热点. 该研究采用特异性自体DC疫苗与抗病毒药物治疗相结合, 对HBV慢性感染者的临床效应进行了观察.

1 材料和方法
1.1 材料

选自我院肝病中心2004-05/2005-12门诊与住院的HBV慢性感染者41例, 其中慢性携带者22例, 慢性乙型肝炎(CHB)19例, 诊断标准符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》[1]. 受试者均不合并其他肝炎病毒感染, 亦不合并其他严重并发症(表1), 同时全部获得了知情同意. 主要仪器: CO2培养箱(Thermo Forma, 美国), 倒置显微镜(Olympus, 日本), 流式细胞仪(Coulter, 美国), 全自动酶标仪(Thermo, 芬兰). 主要试剂: rhGM-CSF、rhIL-4、RPMI1640培养液、鼠抗人CD40, CD83, 均购自河北博海生物工程有限公司. HBsAg购自中国预防医学科学院病毒所.

表1 41例受试者一般特征.
诊断n性别
年龄(岁)
自觉症状
<2020-30-40-50-
慢性携带22157211540517
慢性肝炎1916318541910
合计41311031910811427
1.2 方法

在无菌条件下抽取受试者外周静脉血20 mL, 肝素抗凝, 在百级试验室进行下面操作, 生理盐水1:1稀释抗凝血, 层加到淋巴细胞分离液2000 r/min离心30 min, 分离出外周血单核细胞并计数, 用1640液洗2次, 再加入含有体积分数150 mL/L人AB血清的1640完全培养基重悬细胞. 以2×109/L的细胞浓度加入一次性6孔培养板中, 于37 ℃ 50 mL/L CO2饱和湿度下培养4 h, 吸弃上清液, 再用1640培养液轻洗2次, 除去非贴壁细胞, 加入含8335 μkat/L rhGM-CSF和8335 μkat/L rhIL-4的完全培养基, 隔日换液, 培养至第6天再加入终浓度为2.5 mg/L的HBsAg, 4 h后加入终浓度为10 μg/L的TNF, 继续在37 ℃ 50 mL/L CO2饱和湿度下培养1 d, 收获DC用生理盐水洗涤2次并计数, 即刻在受试者腋下部位常规消毒后经皮下注入体内[2-6]. 同时取细胞洗液做无菌实验. 采用自身前后对照, 对41例HBV慢性感染者, 在试验前均应用IFN-α-2b 500万单位/次肌注隔日一次, 治疗6 mo无应答者停药6 mo后继续IFN-α-2b治疗6 mo, 同时联合自体DC回输治疗, 回输2次为一疗程(间隔2 wk). 治疗结束后1 mo, 观察受试者HBV DNA、乙肝五项及ALT、AST指标的变化. 在回输前后起始的检测指标均一致的基础上, 对DC回输前后做自身比较.

统计学处理 计量资料用mean±SD表示, 进行t检验. 计数资料用χ2检验和Fisher精确概率检验以及等级相关分析(Spearman法). 全部资料均用SPSS10.0软件包处理.

2 结果
2.1 DC体外培养扩增

外周血单核细胞贴壁4 h后获得黏附细胞, 加入细胞因子24 h后贴壁细胞减少, 悬浮细胞渐增多, 随培养时间延长至第6天呈积聚现象, 并可见到悬浮细胞具有树突样突起(图1), 台盼蓝染色细胞存活率达95%以上.

图1
图1 培养第6天透射电镜下DC形态(×4000).
2.2 外周血DC特征标志

DC培养第6天后, 经流式细胞仪检测DC表面CD83的表达(图2). 经组化免疫检测DC表面CD40的表达(图3).

图2
图2 流式细胞仪检测DC表面抗原分析. A: DC促成熟前CD83表达; B: DC促成熟后CD83表达.
图3
图3 免疫组化检测DC表面CD40的表达(×400).
2.3 HBsAg致敏DC

细胞培养至第6天, 加入终浓度为2.5 mg/L的HBsAg, 4 h后再加入终浓度为10 μg/L的TNF继续培养1 d, 收获DC(图4).

图4
图4 培养结束收获DC透射电镜下形态(×3500).
2.4 41例HBV慢性感染者DC回输前后生化学指标的变化

结果显示, ALT, AST在DC回输前与回输后的生化学单项应答比较有明显差异(P<0.01, 表2).

表2 HBV慢性感染者DC回输前后生化指标单项应答比较(mean±SD, IU/L).
分组nALTAST
IFN-α-2b4160.40±31.4354.29±31.07
IFN-α-2b+DC4141.76±24.9241.80±23.64
T2.9762.049
P<0.01<0.05
2.5 41例HBV慢性感染者DC回输前、后血清学指标单项应答的变化

回输前HBsAg阳性数41例, HBsAb阳性数0例, HBeAg阳性数27例, HBeAb阳性数4例, HBcAb阳性数39例. 回输后, HBsAg阳性数41例, HBsAb阳性数0例, HBeAg阳性数27例, HBeAb阳性数3例, HBcAb阳性数41例. 以上数据显示了回输前后无显著性差异.

2.6 DC回输前后病毒学单项应答反应变化

结果显示, 回输前41例受试者均无应答反应, 但回输后完全应答4例、应答18例、无应答减至19例, 有统计意义, 病毒学单项总应答率达53.7%(表3).

表3 受试者DC回输前后病毒学单项应答反应比较(n = 41).
分组DC回输前后病毒学单项应答反应类型
总应答率(%)
完全应答应答无应答
IFN-α-2b00410/41(0.0)
IFN-α-2b+DC4181922/41(53.7)
显著性检验确切概率χ2 = 21.45χ2 = 26.45χ2 = 26.45
P = 0.058P<0.005P<0.005P<0.005
2.7 自体DC回输次数与病毒学应答反应类型的关系

结果显示, 自体DC回输次数与病毒学应答反应类型无直线相关关系, 作等级相关分析(r = 0.048, P>0.05, 表4).

表4 自体DC回输次数与病毒学应答反应的关系(n).
回输次数病毒学单项应答反应类型
合计
完全应答应答无应答
1-307714
4-6111315
>730912
合计4181941
2.8 HBV携带的时间与病毒学应答反应的关系

结果显示, 携带病毒时间与病毒学应答反应的类型无量效应关系, 等级相关分析(r = 0.137, P>0.05, 表5).

表5 HBV携带时间与病毒学反应的关系(n).
持续时间(年)病毒学单项应答反应类型
合计
完全应答应答无应答
<10213924
10-1914813
>201124
合计4181941
3 讨论

乙型肝炎病毒感染的慢性化是一个较大的群体, 在我国约占全世界的1/3. 每年由于慢性乙肝死亡的约30万例[7-11]. 着眼于这方面的防治研究一直是国家的重点也是热点课题. 目前尚无理想方法根除体内HBV的情况下, 减缓或阻断慢性化进程是当前重要的治疗策略.

HBV感染后慢性化的形成与发展是非常复杂的过程, 其中宿主的免疫应答缺陷, 特别是细胞免疫功能低下, 不能产生有效的细胞毒性T细胞(CTL)反应, 导致了HBV的持续感染. 树突状细胞作为功能最强的抗原提呈细胞和免疫反应的启动者[8-15], 在HBV感染后可能成为决定急性自限性感染或是慢性感染的标志. 随着对DC体外分离、扩增和培养技术方面基础研究的进展, 带动了临床治疗学研究的发展. 该研究在建立了DC体外分离、扩增以及HBsAg致敏的实验研究基础上, 对41例HBV慢性感染者进行自体回输特异性DC疫苗同时联合抗病毒药物治疗, 以自身前后对照设计模式, 作了临床观察. 依据慢性乙型肝炎防治指南的标准[16], 采用单向应答标准, 对其效应分析如下: 受试者41例均为HBV慢性感染者, 经过IFN-α-2b治疗6 mo后, 在此基础上停药6 mo后再继续IFN-α-2b治疗, 同时联合自体特异性DC疫苗回输治疗. 实验结果显示, IFN-α-2b联合DC回输的干预措施, 单项生化学应答反应及单项病毒学应答反应均优于单纯IFN-α-2b的干预措施. 其ALT, AST复常或下降, DC回输前后比较有统计学意义(P<0.01, P<0.05). 病毒学应答反应表现在HBV DNA载量下降或转阴, DC回输前后比较有统计学意义(P<0.05), 病毒学总应答率53.7%. 以上结果表明了自体特异性DC疫苗的治疗, 能够抑制病毒复制, 降低感染者的血清病毒载量. 有可能在于DC体外试验可促使其成熟和功能的完善, 回输体内后有利于促进干扰素的抗病毒疗效, 而干扰素治疗又有诱导HBV慢性感染者血源性DC产生的作用, 或增加血源性DC的前体细胞, 使之易于向DC分化. 此种联合治疗的临床研究较为鲜见. 特别针对慢性携带状态的青年人群, 应采取积极的治疗措施, 尽早消除升学、就业、婚姻等问题的困惑.

研究还观察到自体DC回输次数与病毒学应答反应无直线相关关系. 表明了随着DC回输次数增加, 并不能改善病毒学应答反应. 当然这与体外获得的DC状态是否典型(如树突明显, 且发亮, 胞体折光性好, 有成簇的DC出现, 大量悬浮等)和DC的数量应越多越好有直接关系[17-18], 并考虑到回输后的DC在体内维持其活性的时间长短等因素. 为此, DC疫苗的临床治疗效果与回输次数之间无明显的直接关系. 该研究还观察到了病毒学应答类型与HBV持续携带时间无量效应关系, 经等级相关分析. 在此基础上拟进一步扩大DC研究的范围, 从多学科、多因素、多中心的角度探讨与治疗效应有关的因素, 及因素与因素之间的交互作用的研究, 从而推进临床治疗学的进展.

总之, 针对HBV的免疫应答低下是病毒持续存在, 感染慢性化的主要原因[19-26]. 因此, 重建宿主细胞免疫功能将是治疗措施之一[27]. 但值得注意的是目前的研究结果大多是以体外培养扩增DC为研究重点, 而经体外培养扩增乃至用HBsAg冲激的DC, 其性质有可能有别于体内自然存在的微环境状态下的性质[28-32]. 因此, 要客观的对待体外DC研究的结果. 更应注意DC双重性作用. 人体的免疫调节, 实为一个非常复杂的, 多位点的调控系统, 对今后DC的制备和应用的研究, 要进一步作出一套相适应的质控标准和在临床应用方面的规范条件.

志谢

本文得到王锡育主任的大力帮助, 张明辉副主任、马文波、解从君、张丽霞、刘静医师的参加, 一并致谢.

评论
背景资料

近年来随着生物疗法的进展, 人们对树突状细胞(DC)体外扩增和抗原致敏的研究已成为热点, 将其制备成特异DC疫苗用于慢乙肝的治疗已引起了广泛关注.

研发前沿

特异DC性疫苗对HBV慢性感染者的治疗已引起广为关注, 为临床治疗开辟了新的途径. 但经体外扩增乃至用HBsAg致敏的DC, 其性质有可能有别于体内自然存在的微环境状态下的性质. 因此, 更应深入研究体内、外诸多因素与疗效的关联.

应用要点

目前研究表明, 机体的B细胞和T细胞介导的免疫反应是由DC所调控, 从而激发免疫反应, 使侵入机体的病毒得以清除. 因此应用自体DC疫苗回输治疗HBV慢性感染的研究开辟了治疗学的新方向, 应用前景广泛.

名词解释

树突状细胞(DC): 是起源于骨髓的最强的专职抗原提呈细胞(APC), 具有启动T细胞介导的免疫应答功能, 因其形态上具有许多突起而得名. DC在免疫应答中起了举足轻重的作用;

自身前后对照设计: 是指研究对象不分组, 将实验分为前后两个阶段, 第一阶段的治疗结束后, 经过洗脱期待药物残留效果在体内完全消失, 再开始第二个阶段的治疗, 在治疗结束后比较两种措施的效果. 此种设计可比性好, 消除了不同个体间的差异, 减少了偏倚.

同行评价

DC自体回输, 是近几年抗病毒研究的一个热点, 利用HBV特异蛋白在体外预先制备的DC而制成自体疫苗可望成为未来的治疗办法. 文章有一定的新颖性, 方法可靠, 结果可信, 有实际意义.

编辑:王晓瑜 电编:张敏

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