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世界华人消化杂志. 2006-10-18; 14(29): 2880-2882
在线出版日期: 2006-10-18. doi: 10.11569/wcjd.v14.i29.2880
蛋白质二硫键异构酶在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达及意义
王孟春, 郭静波, 刘明华, 方文刚, 李岩
王孟春, 郭静波, 刘明华, 李岩, 中国医科大学附属第二医院消化内科 辽宁省沈阳市 110004
方文刚, 中国医科大学发育生物教研室 辽宁省沈阳市 110001
基金项目: 辽宁省教育厅基金资助项目, No. 202010794.
通讯作者: 王孟春, 110004, 辽宁省沈阳市, 中国医科大学附属第二医院消化内科. wangmc@cmu2h.com
电话: 024-83956416 传真: 024-23892617
收稿日期: 2006-06-20
修回日期: 2006-08-01
接受日期: 2006-08-14
在线出版日期: 2006-10-18

目的: 了解蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)在幽门螺杆菌(H. pylori)感染人胃黏膜组织中的表达情况.

方法: 分别应用半定量RT-PCR方法及Western blot方法检测感染(n = 32)与未感染(n = 28)H. pylori的人胃黏膜组织中PDI mRNA及蛋白的表达情况.

结果: 未感染组PDI mRNA及蛋白表达量分别为0.5704±0.0794, 0.5198±0.0379, 感染组PDI mRNA及蛋白表达量分别为1.0642±0.1533, 0.8252±0.0321; 两组相比差异显著(P<0.01).

结论: 正常情况下胃黏膜组织有PDI mRNA的表达及蛋白的合成, H. pylori感染可使胃黏膜增加PDI mRNA的表达及蛋白的合成.

关键词: 幽门螺杆菌; 蛋白质二硫键异构酶
引文著录: 王孟春, 郭静波, 刘明华, 方文刚, 李岩. 蛋白质二硫键异构酶在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达及意义. 世界华人消化杂志 2006; 14(29): 2880-2882
Expression of protein disulfide isomerase in gastric mucosa infected with Helicobacter pylori
Meng-Chun Wang, Jing-Bo Guo, Ming-Hua Liu, Wen-Gang Fang, Yan Li
Meng-Chun Wang, Jing-Bo Guo, Ming-Hua Liu, Yan Li, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Wen-Gang Fang, Department of Developmental Biology, College of Basic Medical Science, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Correspondence to: Meng-Chun Wang, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. wangmc@cmu2h.com
Received: June 20, 2006
Revised: August 1, 2006
Accepted: August 14, 2006
Published online: October 18, 2006

AIM: To study the expression of protein disulfide isomerase (PDI) in gastric mucosa infected with H. pylori.

METHODS: Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to examine the mRNA and protein expression of PDI, respectively, in human gastric mucosa with or without H. pylori infection (n = 32 or 28).

RESULTS: The expression amounts of PDI mRNA and protein were 0.5704 ± 0.0794 and 0.5198 ± 0.0379 in the mucosa without H. pylori infection, which were significantly lower than those in the ones with H. pylori infection (1.0642 ± 0.1533, 0.8252 ± 0.0321, P < 0.01).

CONCLUSION: H. pylori infection can increase the transcription of PDI mRNA and synthesis of PDI protein in gastric mucosa.

Key Words: Helicobacter pylori; Protein disulfide isomerese
0 引言

生物细胞在受热和其他许多损害因素如缺血、缺氧、感染等作用后发生热休克反应, 可以抑制一些正常蛋白质的合成, 同时启动一类新的蛋白质合成基因-热休克蛋白基因, 合成热休克蛋白(heat shock protein, HSP). 人胃黏膜感染幽门螺杆菌(helicobacter pylori, H. pylori)后同样可发生热休克反应, 产生许多HSP. 蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)为热休克蛋白, 又是内质网分子伴侣家族重要成员, 作为酶PDI可催化蛋白质分子中二硫键的形成, 作为分子伴侣PDI在蛋白质的翻译及翻译后进行的转运过程中起着重要作用. 有关H. pylori感染胃黏膜后的热休克反应中是否有PDI参与及其作用如何尚未见研究报道. 本文以RT-PCR方法及Western blot方法分别检测了H. pylori感染后胃黏膜组织中PDI mRNA及蛋白的表达状况.

1 材料和方法
1.1 材料

胃镜检查时将除外心脑血管、肝肾疾病, 检查前2 wk未用抗生素及铋剂的患者列入本实验. 于胃镜检查时取胃窦黏膜6块, 分别用于快速尿素酶试验、Giemsa染色、RNA提取、蛋白提取. 快速尿素酶试验、Giemsa染色同时阳性为H. pylori感染组, 共32例, 其中浅表性胃炎12例, 胃溃疡10例, 十二指肠溃疡10例. 2项检测同时阴性为H. pylori未感染组, 共28例, 其中基本正常胃黏膜10例, 浅表性胃炎8例, 胃溃疡5例, 十二指肠溃疡5例. 所需试剂为TRIzol试剂, Gibco BRL; AMV逆转录酶, 5×buffer、RNAsin, Promega; Taq酶, dNTP, 10×buffer, MgCl2, Takara公司; 50×TAE 琼脂糖, 上海生工生物制品公司; ECL试剂盒, Amerham Phamarcia; 一抗、二抗分别为小鼠抗羊PDI多克隆抗体, Santa Cruz; HRP标记羊抗小鼠二抗, 中山公司.

1.2 方法

1.2.1 PDI mRNA表达的检测: 胃镜下于胃窦大弯、小弯各取黏膜1块, 置于预冷的装有200 μL TRIzol的EP管中, 用TRIzol试剂盒提取总RNA, 用紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度, 两步法RT-PCR扩增, 为校正逆转录效率及不同样品间的差异, 以β-actin为内部参照物, 在同一反应体系中与PDI同时扩增, 以定量PDI mRNA的表达量, 与β-actin的比值作为校正后的PDI mRNA表达量. 反应条件: 94 ℃ 10 min后, 94 ℃变性1 min、58 ℃复性45 s、72 ℃延伸45 s, 进行30循环后, 72 ℃进行10 min延伸反应. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 在紫外灯下确认电泳带, PDI为478 bp, β-actin为750 bp. 在凝胶成像系统分别扫描PDI与β-actin电泳带密度, 求出二者比值, 即为PDI表达的相对水平.

1.2.2 PDI蛋白表达: 胃镜检查时于胃窦大弯、小弯各取黏膜1块, 裂解液中匀浆、低温离心, 考马斯亮蓝法定量. 含15 μg蛋白的样品在80 g/L SDS-PAGE进行电泳, 半干转印仪至PVDF膜, 将PVDF膜浸入封闭液中室温过夜, 加入用杂交液按1:1000稀释的一抗, 摇床上室温杂交30 min至2 h或过夜. 加入用杂交液按1:5000稀释的二抗, 摇床杂交30 min. 将ECL试剂盒内的detection reagent 1与detection reagent 2等体积混合后, 均匀滴在PVDF膜上, 固定于暗盒中, 曝光、洗片. 电脑扫描, Kodak1D软件系统计算PDI的密度值及β-actin的密度值, 二者比值作为该样品PDI蛋白的表达量.

统计学处理 数据经SPSS 10.0软件t检验处理, 以mean±SD表示, P<0.05为有显著差异.

2 结果
2.1 PDI mRNA表达的检测结果

H. pylori阳性组不同病变胃黏膜PDI mRNA表达量无差异, H. pylori阴性组不同病变胃黏膜PDI mRNA表达量无差异(表1). H. pylori阳性组胃黏膜PDI mRNA表达量明显高于H. pylori阴性组(P<0.01, 表2).

表1 H. pylori对不同胃黏膜组织PDI mRNA及蛋白表达的影响 (mean±SD).
分组PDI mRNA
PDI蛋白
nH. pylori 阳性nH. pylori 阴性nH. pylori 阳性nH. pylori阴性
基本正常胃黏膜100.5789±0.0706100.5160±0.0447
浅表胃炎(中-重度)121.0683±0.139780.5716±0.0581120.8160±0.024980.5222±0.0293
胃溃疡101.0734±0.161750.5441±0.0565100.8381±0.033950.5290±0.0437
十二指肠溃疡101.0499±0.159050.5779±0.0565100.8233±0.033750.5207±0.0267
表2 H. pylori感染与未感染胃黏膜组织中PDI mRNA及蛋白的表达(mean±SD).
分组nPDI mRNAPDI蛋白
H. pylori 阴性280.5704±0.07940.5198±0.0379
H. pylori 阳性321.0642±0.1533b0.8252±0.0321b
bP<0.01 vs H. pylori 阴性组.
2.2 PDI蛋白表达结果

H. pylori阳性组不同病变胃黏膜PDI蛋白表达量无差异, H. pylori阴性组不同病变胃黏膜PDI 蛋白表达量无差异(表1). H. pylori阳性组PDI蛋白表达量明显高于H. pylori阴性组(P<0.01, 表2).

3 讨论

胃黏膜是热休克反应的代表, 无论是离体培养的胃黏膜细胞还是动物实验、人胃黏膜均有HSP的多量表达[1-5]. 而感染H. pylori后更增加了某些热休克蛋白的合成[6-7], 如HSP70, HSP72, HSP90等, 我们曾报道胃黏膜感染H. pylori后可增加内质网分子伴侣Grp94、Grp78的合成[8-9], 可能与H. pylori感染后胃黏膜合成的一些细胞因子、激素等有关, 也可能在维持胃黏膜细胞正常形态及功能上起重要作用. 本实验检测了另一个内质网分子伴侣PDI的表达情况, 同样发现PDI在胃黏膜有基础表达,H. pylori感染组PDI mRNA及蛋白的表达均明显高于H. pylori未感染组, H. pylori感染组与未感染组不同胃黏膜病变中的表达无差异性, 提示H. pylori感染后胃黏膜也增加了PDI的合成. PDI是一种多功能分子伴侣存在于内质网管腔中, 含量丰富, 占细胞总蛋白的0.4%. 作为折叠酶PDI能催化蛋白质分子中二硫键的形成[10], 作为分子伴侣PDI能识别未折叠好的或部分折叠的新生肽折叠中间物的非天然结构, 或变性蛋白在重折叠过程中形成的折叠中间物的非天然结构, 通过其多肽结合部位与之结合, 从而防止靶蛋白或底物蛋白之间错误的结合和聚合. 目前的研究表明, 在蛋白质折叠过程的早期, PDI可能是作为分子伴侣防止部分折叠的肽链由于错误相互作用导致的聚合; 在后期, 当多肽链已经折叠到一定程度, PDI的基本功能则表现为异构酶, 即催化配对巯基的氧化联接或错接二硫键的异构. 像内质网中的其他分子伴侣一样, PDI也会因为分泌蛋白的过量合成或未折叠好的和错误折叠的蛋白在内质网中的积聚, 而被诱导表达[11].

H. pylori是一种革兰氏阴性杆菌, 本身所具有的毒素、尿素酶、脂多糖等对胃黏膜有损害作用[12-14], 胃黏膜感染H. pylori后上皮细胞发生空泡变性、G细胞、D细胞等也受到影响, 细胞内质网的形态发生变化, 因此, 这些细胞在其分泌粘蛋白、胃肠激素等过程中出现异常, 如在细胞内聚集未折叠好的或错误折叠的蛋白, 就可能激发热休克反应, 激活热休克因子, 使PDI的合成增多, 增多的PDI能防止蛋白错误折叠, 催化二硫键的形成, 从而维持胃黏膜细胞的正常功能. PDI的增多到底与哪些胃肠激素的合成分泌有关, 这也是我们感兴趣的问题, 有待今后进一步探讨.

评论
背景资料

人胃黏膜感染幽门螺杆菌后发生热休克反应, 产生许多热休克蛋白. 蛋白质二硫键异构酶为热休克蛋白, 同时是内质网分子伴侣家族重要成员, 有关幽门螺杆菌感染胃黏膜后的热休克反应中是否有蛋白质二硫键异构酶参与及其作用机制如何尚未见研究报道.

同行评价

本文反映了目前幽门螺杆菌感染的基础研究进展, 证实了蛋白质二硫键异构酶在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达及意义. 方法得当, 具有科学价值.

电编:李琪 编辑:王晓瑜

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