乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白的筛选

摘要

目的: 用酵母双杂交技术筛选白细胞与乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白(MHBst)结合蛋白.

方法: PCR扩增MHBst基因, 连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达. 后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)和X-a-半乳糖(X-a-gal)上进行双重筛选阳性菌落增菌后提出质粒转化入大肠杆菌(DH5a), 并经氨苄青霉素抗性筛选, 提取单克隆菌落质粒, 酶切鉴定, 序列测定后进行生物信息学分析.

结果: 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆8个, 经生物信息学分析, 排除读码框架不正确者, 最后得到7种已知基因, 分别为ADP核糖基因子2种, RAB6相互作用蛋白(RAB6IP1)1种, CCR4-NOT转录复合体亚基10(CCR4-NOT-10)1种, 脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1种, 醛缩酶B (ALDOB)1种, 补体成分3(C3)1种, 丙酮酸脱氢酶(PDH)1种.

结论: 成功克隆出MHBst结合蛋白.

关键词: 酵母双杂交技术; MHBst; 结合蛋白; 克隆

Screening and identification of proteins interacting with C-terminally truncated middle surface protein of hepatitis B virus

Jiang-Ke Tian, Jun Cheng, Yan Liu, Yu-Fang Cui, Dong Ji, Lin Wang, Yong-Qian Cheng, Yan-Wei Zhong, Dong-Ping Xu

Jiang-Ke Tian, Yu-Fang Cui, Department of Immunology, Institute of Radiation Medicine, AMMS, Beijing 100850, China

Jiang-Ke Tian, Yan Liu, Dong Ji, Lin Wang, Yong-Qian Cheng, Yan-Wei Zhong, Dong-Ping Xu, Viral Hepatitis Research Center, Institute of Infectious Diseases, the 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China

Jun Cheng, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China

Supported by: Beijing Natural Science Foundation, No. 5042024

Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, 13 Ditan Park, Anwai Street, Dongcheng District, Beijing 100011, China. cj@genetherapy.com.cn

Received: February 13, 2006
Revised: March 11, 2006
Accepted: March 20, 2006
Published online: August 28, 2006

Abstract

AIM: To screen and identify proteins interacting with C-terminally truncated middle surface protein of hepatitis B virus (MHBst) from human leukocyte cDNA library by yeast two-hybrid system.

METHODS: The MHBst fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and MHBst binding protein bait plasmid pGBKT7-MHBst was constructed by yeast-two hybrid system. Then plasmid pGBKT7-MHBst was transformed into yeast AH109 cells and the expression of MHBst was detected by SDS-PAGE and Western blotting assay. The transformed yeast cells were mated with yeast Y187 containing leukocyte cDNA library plasmid. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) and quadruple dropout (QDO) medium containing X-a-gal for selection. Subsequently, the plasmids of the blue colonies were extracted, transformed into E. coli (DH5a), and then selected by ampicillin. After extraction and digestion, the plasmids were analyzed by DNA sequencing and bioinformatics.

RESULTS: MHBst proteins were successfully cloned and expressed in yeast cells. Eight genes in positive colonies were obtained by yeast-two hybrid technique, including two ADP-ribosylation factor 1, one RAB6 interacting protein 1, one CCR4-NOT transcription complex subunit 10, one lipopolysaccharide binding protein, one aldolase B, one complement component 3 and one pyruvate dehydrogenase.

CONCLUSION: MHBst binding proteins in leukocytes are successfully cloned.

Key Words: Yeast-two hybrid technique; MHBst; Binding protein; Cloning

0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一种严重危害人类健康的致病病毒因子, 除引起急、慢性病毒性肝炎, 慢性肝炎迁延不愈, 导致肝纤维化, 还与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生密切相关[1]. 虽然对于HBV相关性疾病的诊断、治疗有了长足的发展, 但目前具体的HBV致病(癌)机制尚不十分明确. 其中HBV表面抗原组成最为复杂, 通过S开放读码框三个不同的起始密码子(ATG)编码前-S1、前-S2和主S蛋白, 组成表面抗原大蛋白(LHBs), 中蛋白(MHBs)和小(主)蛋白(SHBs). 研究表明, 羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)能够反式激活多种病毒和细胞基因组的表达, 影响细胞生长调节, 在HCC发生过程中起重要作用[2-3]. 由于HBV表面抗原在患者血液中大量存在, 我们拟从蛋白质-蛋白质相互作用的角度, 采用白细胞文库和酵母双杂交技术, 进行筛选, 以期发现与免疫有关的一些基因. 探索白细胞文库中与MHBst结合的蛋白, 进一步阐明MHBst致病的分子机制.

1 材料和方法

1.1 材料

Saccharomyces cerevisiae AH109酵母株、Y187酵母株(K1612-1)均购自Clontech公司; cDNA白细胞文库由本室构建; 酵母YPDA培养基、SD/-Trp培养基SD/-Leu, SD/-Trp/-Leu, SD/-Trp/-Leu/-His, SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade, X-a-半乳糖苷酶(gal)等购自Clontech公司; 半硫酸腺苷、醋酸锂购自Sigma公司; 复杂高效感受态(FSB), 本室自制; 大肠杆菌(DH5a), 本室保存.

1.2 方法

1.2.1 诱饵质粒的构建: 根据董菁et al[4-5]发表的adr亚型HBV的基因序列, 分别设计MHBst编码区的上游和下游引物(上游引物: 5'-GGATCCTCCTGGAGGTAGAAGTAGAGGACAAAC-3', 下游引物: 5'-GGATCCTCAAATGTATACCCAAAGAC-3'), 同时在引物两端引入EcoRⅠ/BamHⅠ内切酶位点. 反应体系25 mL, 以G376-7(GenBank号: AF384371)质粒为模板, PE9600 PCR仪扩增. 9 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果. PCR产物经玻璃奶回收后, 与pGEM-T载体及T4 DNA连接酶混匀, 16 ℃连接过夜, 后转入用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞, 在铺有IPTG及X-gal的氨苄青霉素琼脂糖(LB)平板上进行蓝白菌落筛选, 挑取阳性菌落, 用碱裂解法提取质粒DNA进行酶切鉴定及测序, 正确后亚克隆至pGBKT7载体中, 转化DH5a感受态, 接种于卡那霉素LB平板上, 随机挑取平板上生长的菌落, 碱裂解法抽提质粒DNA, 双酶切及PCR鉴定所得质粒正确, 命名为pGBKT7-MHBst.

1.2.2 MHBst的表达: 按Clontech公司操作手册, 用醋酸锂法转化酵母细胞AH109, 后铺板于SD/-Trp进行筛选. 挑取2-3 mm大小的菌落过夜培养后, 提取酵母蛋白质, 操作步骤按Clontech公司试剂盒说明书进行. 表达产物的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析均按常规方法进行. 并在四缺培养基上培养排除其自身激活作用.

1.2.3 诱饵与白细胞文库的酵母配合: cDNA白细胞文库进行增菌后, 提出质粒, 转化入酵母细胞(Y187), 经文库滴定, 确定文库细胞计数大于1×10¹²细胞/L. 挑取在SD/-Trp选择培养基上生长转化子(计数大于1×10¹²细胞/L)与白细胞文库混合, 30 ℃轻摇配合过夜, 24 h后铺板SD/-Trp/-Leu/-His 25块、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 25块. 同时进行阳性对照实验及文库滴定. 16 d后将大于3 mm的酵母集落, 在铺有X-a-gal的QDO培养基上检查a-gal活性, 在QDO培养基上生长且出现蓝色菌落的视为阳性集落.

1.2.4 阳性质粒的克隆和分析: 挑取阳性集落按照试剂盒提供的操作指南Lyticase法提取酵母质粒. 提取的质粒以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠杆菌, 于含有氨苄青霉素的SOB平板培养, 所获得的菌落酶切鉴定后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank, 进行生物信息学分析, 并将所获新的基因存入GenBank数据库.

2 结果

2.1 MHBst酵母表达载体的鉴定

利用自行设计的引物成功扩增出MHBst基因(图1), 连接pGEM-T载体后EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定, 与预期片段符合, 回收酶切产物连接到用相同酶所切的pGBKT7载体中, 再次酶切鉴定结果正确(图2).

图1 MHBst PCR产物扩增结果. 1: DL 2000 DNA标准; 2: MHBst PCR产物.

图2 pGBKT7-MHBst酶切鉴定结果. 1: DL 2000 DNA标准; 2: pGBKT7-MHBst酶切产物(EcoR I/BamH I); 3: DL 15000 DNA标准.

2.2 MHBst基因在酵母细胞中的表达

提取转化了pGBKT7-MHBst质粒的酵母细胞(AH109)蛋白质, 进行SDS-PAGE和Western免疫印迹分析. 结果显示对照无表达而转化了pGBKT7-MHBst的Western印迹分析可见明显目的条带且无杂带(图3).

图3 酵母(AH109)蛋白提取物免疫印迹分析结果. 1: 空酵母细胞对照组; 2: 转化了pGBKT7-MHBst的酵母细胞组.

2.3 部分筛选克隆BglⅡ酶切鉴定结果

pACT2内含有两个BglⅡ酶切位点, 分别位于多克隆位点两侧, 使用该酶消化将释放出插入的白细胞文库片段(图4).

图4 几种不同的克隆BglⅡ酶切鉴定. M: DL 2000 DNA标准; 1-8: 不同克隆酶切鉴定结果.

2.4 cDNA测序与同源性分析初步结果

cDNA测序与同源性分析初步结果配合后筛选出在4缺(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)培养基与在铺有X-a-gal的4缺培养基上均能生长并变成蓝色的阳性菌落8个克隆并测序, 与GenBank数据库进行初步比较, 8个克隆与已知基因的部分序列高度同源(95%-100%)(表1).

表1 与MHBst相互作用的白细胞蛋白分析结果.

序号	同源基因	GenBank号	相同克隆数	同源性
1	脂多糖结合蛋白(LBP)	NM_004139	1	100%
2	CCR4-NOT转录复合体亚基10(CNOT10)	NM_015442.1	1	95%
3	ADP核糖基因子1	BC010415	2	100%
4	RAB6相互作用蛋白1(RAB6IP1)	NM_015213.2	1	100%
5	醛缩酶B(ALDOB)	X02747	1	100%
6	补体成分3(C3)	NM_000064	1	99%
7	丙酮酸脱氢酶(PDH)	AF334710	1	99%

3 讨论

酵母双杂交系统是近年来新发展起来的一种分析真核细胞蛋白-蛋白相互作用的一种有效的基因分析方法, 他的产生为研究蛋白在体内生理情况下相互作用提供了遗传学方法. 我们选用Clontech公司的Matchmaker酵母双杂交系统-3, 单倍体细胞株AH109带有4种报告基因分别为HIS3(组氨酸), ADE2(腺苷), MEL1(a-半乳糖苷酶), 加上两种载体中分别带有的TRP1(色氨酸)和LEU2(亮氨酸), 使得筛选后阳性菌落能在缺乏上述4种氨基酸营养的培养板上生长. 由于MEL1基因表达的a-gal为分泌型蛋白, 可以在固相培养基中直接与X-a-gal底物相互作用, 显示为蓝色, 相对于检测b-gal来说操作得到了极大的简化. 该系统由于增加了报告基因的种类, 使筛选结果阳性率达到95%[6-7]. 我们应用酵母双杂交技术筛选MHBst, 从病毒蛋白-宿主蛋白相互作用的角度, 探索HBV感染的发病机制.

在所筛选到的蛋白中, 我们感兴趣的是脂多糖(LPS)结合蛋白(LBP), 他是一种糖蛋白, 存在于正常人和动物血清中, 由肝细胞合成, 相对分子质量为60 kDa, 由456个氨基酸组成. LBP与LPS的脂质A具有高度亲和性, 能识别并结合LPS, 形成LPS/LBP复合物, 从而发挥病理、生理作用: (1)介导炎症反应. 一方面通过膜上LPS/LBP复合物受体膜结合CD14(mCD14), 激活单核巨噬细胞和中性粒细胞等, 使其产生TNF, IL-1, IL-6等炎性介质, 其中TNF最为重要. TNF是致机体产生炎症反应和休克的重要因子, LBP能明显增强LPS对TNF的诱生作用, 增加TNF mRNA转录的速度, 使TNF浓度从40 U/mL迅速上升到10000 U/mL. LBP本身并不能诱导TNF mRNA的转录和TNF的产生, 但缺少LBP的结合, LPS就不能明显地刺激TNF的产生. LPS-LBP与mCD14的结合能促使单核/巨噬细胞激活并释放多种细胞因子, 研究表明, 慢性肝炎患者血清LBP含量高于肝硬化患者, 说明LBP在早期肝脏损害中起关键作用[8-9]. 另一方面, 通过可溶性CD14(sCD14)激活、损伤血管内皮细胞, 促进炎性因子向血管外渗透, 促进单核细胞等与血管内皮细胞黏附并进入组织, 加重炎症反应; 进入细胞间质的LBP, 还可刺激巨噬细胞、上皮细胞和平滑肌细胞, 增强其对LPS的反应性. (2)缓解炎症反应. LBP可通过调理作用, 促进单核细胞等吞噬被调理的LPS或细菌, 及时清除进入体内的LPS和革兰阴性菌. LBP还可催化LPS与高密度脂蛋白(HDL)结合, 而HDL则能够结合LPS, 并中和LPS的生物学活性. 但LBP的生理功能是以传递LPS、介导细胞反应为主, 即LBP介导炎症反应的活性较缓解炎症反应的活性强[10]. 我们发现MHBst可以与LBP结合, 提示了其参与了肝细胞炎症的发生、发展过程, 从而丰富了对HBV表面抗原功能的理解.

通过以上结果提供的线索, 我们可以进行更深入的研究, 进一步弄清各种蛋白对MHBst生物学功能的影响其确切的作用, 为寻找阻断HBV感染及HCC发生的有效方法开辟新道路. 当然, 这些结合蛋白的发现只是研究病毒蛋白功能的一个起点, 在极其复杂的体内环境中, 需要更多的实验证据来揭示这种结合的生物学意义.

评论

背景资料

乙型病毒性肝炎是由HBV感染引起的世界性传染, 目前还没有特效的治疗方法. HBV属嗜肝DNA毒, 其基因组功能单位十分密 集, 高度压缩, 重复利用, 目前己确定有4个主要的开放读码框, 编码至少7个蛋白, 包括3个表面抗原: 包膜蛋白前-S 1前-S2、S; 核心抗原(HBcAg); e抗原(HBeAg); 病毒多聚酶(P); X蛋白(HBxAg). 其中MHBst为截短型表面抗原中蛋白, 其与肝细胞之间的具体作用机制尚不清楚, 研究MHBst与肝细胞间的相互作用蛋白, 可能是解决HBV感染的有效途径之一.

应用要点

通过深入的提示MHBst与其相关蛋白的相互作用, 为今后更加广泛深入地研究新基因的生物学功能打下基础. 以期得到一些与HBV感染性疾病相关的基因, 从而为进一步理解HBV感染致病机制并且指导临床治疗、预 防措施.

名词解释

酵母双杂交(yeasttwo hybrid)系统: 是近年来新发展起来的一种分析真核细胞中蛋白/蛋白相互作用的有效的基因分析方法, 他的产生为研究蛋白在体内生理情况下的相互作用提供了一种新的遗传学方法, 酵母双杂交系统通过将两个推定有相互作用的蛋白X和Y分别融合到一酵母转录激活因子的BD和AD上, X与Y的相互作用重构了激活因子, 从而导致下游报告基因的转录, 产生容易探测到的表型.

同行评价

本文研究首次使用白细胞文库进行MHBst的酵母双杂交筛选, 设计思路新颖, 实验方法简单可靠.

备注

电编:李琪 编辑:潘伯荣

参考文献

1.	Ganem D, Prince AM. Hepatitis B virus infection--natural history and clinical consequences. N Engl J Med. 2004;350:1118-1129.  [PubMed]  [DOI]

2.	刘 妍, 成 军, 张 跃新, 段 惠娟, 牟 劲松, 韩 萍, 李 克, 李 莉, 张 玲霞, 陈 菊梅. 截短型HBsAg中蛋白反式激活基因的克隆. 中华传染病杂志. 2002;20:218-221.  [PubMed]  [DOI]

3.	刘 妍, 成 军, 王 刚, 李 克, 段 惠娟, 王 琳, 李 莉, 张 玲霞, 陈 菊梅. HCV核心蛋白与截短型HBV表面抗原中蛋白协同反式激活功能的研究. 中华肝脏病杂志. 2002;10:354-357.  [PubMed]  [DOI]

4.	董 菁, 李 进, 施 双双, 皇甫 竞坤, 成 军, 王 勤环, 洪 源, 李 莉. 乙型肝炎病毒基因组准种与变异特点的研究. 解放军医学杂志. 2002;27:116-118.  [PubMed]  [DOI]

5.	董 菁, 成 军, 王 勤环, 王 刚, 施 双双, 刘 妍, 夏 小兵, 斯 崇文. 外周血中乙型肝炎病毒截短型囊膜蛋白基因的克隆化与序列分析. 中华肝脏病杂志. 2001;9:163-165.  [PubMed]  [DOI]

6.	Wang XZ, Jiang XR, Chen XC, Chen ZX, Li D, Lin JY, Tao QM. Seek protein which can interact with hepatitis B virus X protein from human liver cDNA library by yeast two-hybrid system. World J Gastroenterol. 2002;8:95-98.  [PubMed]  [DOI]

7.	Gietz RD, Woods RA. Screening for protein-protein interactions in the yeast two-hybrid system. Methods Mol Biol. 2002;185:471-486.  [PubMed]  [DOI]

8.	赵 虎, 周 庭银. 脂多糖结合蛋白及其拮抗剂的研究进展. 国外医学预防、诊断、治疗用生物制品分册. 1999;22:215-218.  [PubMed]  [DOI]

9.	尹 彪, 于 敏, 曾 争, 田 庚善. 病毒性肝炎患者血清脂多糖结合蛋白检测及其意义. 中华实验和临床病毒学杂志. 2001;12:226-227.  [PubMed]  [DOI]

10.	左 国庆, 何 松, 刘 长安, 龚 建平. 实验性酒精性肝病时脂多糖结合蛋白和脂多糖受体CD14的表达. 中华肝脏病杂志. 2002;10:207-210.  [PubMed]  [DOI]