修回日期: 2006-04-11
接受日期: 2006-05-15
在线出版日期: 2006-06-08
在肝细胞癌(HCC)发生发展过程中, 伴随着原癌基因和抑癌基因的突变, 各种参与调控的细胞因子表达也发生异常并最终影响疾病的进程和转归. 目前对肝细胞癌的分子病理学研究已经集中在这些细胞因子的异常表达及其相互关系网络上, HBx蛋白、SAM、TGF等细胞因子的研究已经十分深入, 而且, 随着各种新技术的应用, 更多的低丰度调控蛋白也逐渐被发现, 其在肝细胞癌细胞增殖调控、异常分化、衰老和凋亡调节以及肿瘤演进等方面起着重要作用.
引文著录: 李冬, 张建中. 肝细胞癌基础研究的某些进展. 世界华人消化杂志 2006; 14(16): 1592-1601
Revised: April 11, 2006
Accepted: May 15, 2006
Published online: June 8, 2006
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2006; 14(16): 1592-1601
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v14/i16/1592.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v14.i16.1592
肝细胞癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一, 因其病程进展迅速, 恶性程度高, 治疗困难, 长久以来一直为基础和临床科研人员所关注. 随着人类基因组计划的完成、蛋白质组计划的全面展开以及各种新技术的广泛应用, 肝细胞癌的基础研究也进入了一个全新的领域. 特别是蛋白指纹技术(SELDI)的出现, 使科研人员可以将目光集中在fmol级的小分子、低丰度蛋白上, 大大提高了实验的精确性和特异性. 目前, 对肝细胞癌的研究重点涉及癌基因遗传学改变、异常基因表达对蛋白调控的影响以及蛋白因子相互作用网络等方面, 随着这些研究的深入, 人们对肝细胞癌病理学特点的认识也进入到一个全新的阶段. 本文主要就近几年来肝细胞癌基础研究的某些进展做一介绍, 重点讨论肝癌分子病理学研究中的几个热点问题.
肝细胞癌的发生发展是一多环节、多步骤的复杂过程, 受环境和遗传双重因素的影响. 在环境因素当中, 对乙肝病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、黄曲霉毒素B1、乙醇性肝硬化致癌作用的研究都已取得相当大的进展, 但患者遗传背景的差异在肝癌发生学上的意义尚不十分明了.
癌细胞与正常细胞的不同之处首先在于增殖失控, 常表现为细胞周期进程对生长因子和细胞黏附的非依赖性. 在这个过程当中, 细胞周期相关因子自身的变化、参与的信号转导途径异常都可以引起异常增殖调控.
在HBV诱发肝细胞癌的过程中, X蛋白比其他HBV编码蛋白(如前S蛋白)似乎起更为重要的作用[1]. X蛋白是HBV基因组编码的一种多功能蛋白, 其功能包括酪氨酸磷酸激酶活性、p53蛋白结合活性、肝癌候补基因的转录激活、FAK、Src激酶活化作用[2-3]及DNA切除修复系统抑制作用等. 在氯霉素乙酰转移酶实验中, HBx蛋白通过影响p53基因启动子上的E-box单元, 明显抑止了p53基因的表达, 进而抑止了p53介导的转录激活, 使肝癌细胞抑癌蛋白PTEN的表达下调, 激活AKT信号通路, 促使细胞异常增生. 与此同时, p53抑止HBV增强子活性的能力也已被早先的实验所证实. 这些证据提示, p53和HBx在蛋白水平上相互抑制的转化在HBV相关肝细胞癌形成中可能起到决定性的作用. 然而, Zhu et al[4]认为, 单纯HBx基因表达并不足以引起肝细胞癌, 但可能是细胞恶性转变的一个促进因素. 该实验是将C57-TgN(HBx)转基因鼠和C57BL/6系小鼠分组后进行单剂量二乙基亚硝胺(DEN)对照处理, 发现在DEN处理组转基因鼠较C57BL/6小鼠表现出更明显的肝细胞嗜碱性变, 肝细胞癌和肝细胞腺瘤发生率亦明显增加.
HCV感染是肝细胞癌的另一个重要诱发因素, 其中2 a基因型病毒常见复制性感染, 而1 a基因型病毒伴有肝硬变和肝癌, 并对IFN治疗相对耐受[5]. 尽管由HCV引发的肝细胞癌发病机制尚不清楚, 但其编码的非结构蛋白5A(NS5A)确实表现出一种细胞增殖调控活性[6]. NS5A可以激活转录信号传导及激活因子3家族(STAT3)的磷酸化作用, 后者进而易位进入细胞核. 在体外研究中, STAT3的激活作用也可以在表达HCV NS5A的转基因鼠内观察到. 应用荧光素酶基因表达法显示, 肝细胞中NS5A调控STAT3下游分子Bcl-xL和p21的表达. 与此同时, NS5A还通过与Jak1激酶的协同作用活化STAT3, 最终引起细胞异常增殖. 脱-g-羟基凝血素(DCP)也可以导致细胞膜表面受体Met磷酸化并通过Janus激酶1活化STAT3信号传导通路[7], 但DCP并不影响分裂素活化的蛋白激酶通路、Myc信号通路和磷酸肌醇3-激酶/Akt通路.
此外, 在长期黄曲霉素作用下, p53基因的249号密码子可能发生特异性突变(p53mt249), 由AAG突变为AGT[8]. p53基因作为最早发现的抑癌基因之一, 可以抑制胰岛素样生长因子受体(IGF-Ⅰreceptor, IGF-IR)和内生型胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-like growth factorⅡ, IGF-Ⅱ)P3转录子的表达, 进而抑制肿瘤生长. IGF-Ⅱ通过与IGF-IR结合, 调控酪氨酸激酶活性, 刺激肝癌细胞的增殖及分化. p53mt249通过自分泌和旁分泌途径同时上调了配体IGF-Ⅱ和受体IGF-IR的表达, 引起癌细胞分裂失控[9], 部分获得促进G0细胞向G1期转变的功能. Kong et al[10]指出, 在体外转录实验中, 锤头核酶(RZ)对突变p53基因的降解率达42%, 同时并不清除野生型p53, 这提示锤头核酶作为一种全新的肝细胞癌基因治疗方法, 可能具有广阔的研究前景.
肝细胞癌中IGF-Ⅱ表达水平的变化目前正引起病理学者们的注意, 在肝细胞癌病灶和外周血中, 游离IGF-Ⅱ的表达均较正常水平明显升高, 并与增殖细胞核抗原(PCNA)水平直接相关, 可以作为肝细胞癌(HCC)诊断、肝外转移灶鉴别诊断和监测术后复发的标记物加以利用[11-12]. 而Alexia et al对HepG2和Huh-7肝细胞癌细胞系进行对比研究后指出, 不同肝细胞癌细胞系对IGF-Ⅱ的反应有所不同, 而IGF-Ⅰ/Ⅱ的自分泌/旁分泌途径促成HCC细胞增殖, 并在体内抵抗细胞调亡[13]. 此外, 在动物实验中, 人源化抗IGF-IR抗体h7C10与化疗药物或针对其他生长因子受体(如表皮生长因子受体)的抗体联合应用具有潜在的抗癌作用[14].
在细胞周期中, 调节细胞增殖的主要事件发生在G1期, 因此, G1期蛋白的异常表达与肿瘤形成关系十分密切. Peng et al[15]对手术切除术后的肝癌进行回顾性研究后发现, 细胞周期蛋白D1表达下调与大体积肝细胞癌(>2.5 cm)以及分化不良(Ⅲ-Ⅳ级)肝细胞癌密切相关, 细胞周期蛋白E的异常过表达是致瘤性转化的重要标志, 并与分化不良及侵袭性癌呈正相关. 同时, 细胞周期蛋白D1表达下调、细胞周期蛋白E的上调与p53基因突变有高度关联. 由此可见, G1期细胞周期蛋白表达紊乱与p53基因突变密切相关, 这些改变对于肝细胞癌的预后具有重要指导意义.
甲基化状态异常在肿瘤发展中的作用已受到日益广泛的重视, 这种异常主要包括抑癌基因高甲基化和癌基因的低甲基化, 前者使抑癌基因表达受到抑制, 而后者则使癌基因表达上调. 肿瘤细胞转录程序的转变(如细胞癌变过程中氧化应激性改变)也使基因表达发生异常. 有研究发现, 在瘤组织及癌前病变中, 伴随着DNA的低甲基化, S-腺苷甲硫氨酸(SAM)表达降低; 而给予6 moSAM持续治疗后, 肿瘤结节明显缩小. 另外, 其他观察也支持SAM对肝细胞癌有化学性抑制作用的观点[16]: (1)外源性SAM可重新构建肝细胞癌癌前病变和肿瘤肝损伤的SAM代谢池; (2)在肝损伤中, DNA的甲基化程度与SAM/SAH(S-腺苷高半胱氨酸)比率呈正相关; (3)DNA甲基转移酶抑制因子5-氮胞苷可被SAM抑制, 而促使肝细胞DNA甲基化; (4)c-Ha-ras、 c-Ki-ras和c-myc基因在癌前病变中呈低甲基化过表达状态, 其表达与SAM/SAH比率呈负相关; (5)SAM可促使细胞DNA全面甲基化.
端粒在体细胞中被认为是细胞的"分裂钟", 随着细胞的分裂而逐渐缩短, 以保证体细胞仅具有有限的增殖特性. 在癌细胞增殖过程中, 端粒末端转移酶被再激活而保持端粒的长度, 使端粒"分裂钟"的控制功能失效. 目前, 对肝细胞癌中端粒末端转移酶作用的研究正在逐步深入. Oh et al[17]通过对慢性肝炎(CH)、低度不典型增生结节(LGDNs)、高度不典型增生结节(HGDNs)、HCC结节中末端限制酶切片断长度(TRFL)和端粒酶活性(TA)进行比较后发现, TRFL和TA在LGDNs和HGDNs中的表达明显不同. 大多数LGDNs表达TRFL和TA水平接近CH, 而与HGDNs相比, LGDNs中TRFL长度减少17%, 7%LGDNs表达高水平的TA, HGDNs表达TRFL和TA水平与HCC十分接近. 由此可见, 在早期肝细胞癌发生过程中, 端粒长度缩短, 通过负反馈机制激活端粒末端转移酶, 这在从LGDNs向HGDNs转化过程中表现的非常明显. 同时, HGDNs的特性被认为更接近于HCCs. 而在体外试验中, HBV的X基因在转染细胞后可以明显上调人端粒末端转移酶反转录酶(hTERT) mRNA的转录表达, 这在HBV感染所导致的肝癌中是一种新的作用机制[18].
干扰素(IFN)作为临床常用的抗肿瘤药物, 可以明显延缓术后复发并改善预后[19], 尽管其抗癌机制尚不完全清楚, 但至少包括通过下游JAK/STAT通路在S期阻止细胞增值、干扰MEK/ERKt通路[20]以及促进细胞凋亡并抑制肿瘤相关的血管形成, 而不同亚型干扰素的抑癌作用也有明显差异, 其中, IFN-b的抗增殖作用明显强于IFN-a, 并更倾向于提高肿瘤细胞的S期比率[21]. 在体外条件下[22]干扰素a Con1(IFN-a Con1)对肝细胞癌细胞系KIM-1和HAK-1B都表现出剂量相关的生长抑制作用, 随着IFN-aCon1剂量的增加, 裸鼠癌灶内的凋亡细胞明显增加, 同时肿瘤血管明显减少, 这提示了IFN-a Con1对肝细胞癌预防和治疗中的临床应用潜能. 此外, 较新的研究还表明, a干扰素家族中不同成员对不同种肝细胞癌细胞系的生长作用也各有不同[23]: 总体来说, IFN-a 8的抑制作用最强, IFN-a2, -a5和-a10的抑制作用居中, 而IFN-a1对所有肝细胞癌细胞系的抑制作用为最小. 与此同时, 不同细胞系对干扰素的敏感度也不同, 这与2',5'-寡腺苷酸合成酶(2'5'-OAS)的诱导作用有关, 这种酶存在于HAK-3细胞系中, KYN-3细胞系中却并不含有2'5'-OAS.
癌细胞的去分化程度常与细胞增殖、肿瘤侵袭性及预后相关: 低分化的肝细胞癌往往异常增生明显、侵袭性较强且预后不良. 因此, 了解癌细胞在去分化过程中的细胞因子调控就具有十分重要的临床及科研意义. Nakano et al[24]采用免疫组化技术对41例肝细胞癌患者体内P-糖蛋白(P-gp)和P53蛋白的分布情况进行分析后发现, P-gp在肝细胞癌和肝硬化中表达明显不同; 在前者, 其表达因组织分化不同也不同. 在分化良好的小梁结构肝细胞癌中, P-gp主要位于小管膜上; 在中等分化的假腺腔样肝细胞癌中, P-gp表达主要分布于腺管细胞膜的腔面上. 在分化良好的肝细胞癌中, P-gp表达率为87%, 高于中等分化和分化不良的癌组织. 与此相对应, 肿瘤抑制基因p53在分化良好的肝细胞癌中突变率为12.5%, 中等分化肝细胞癌为52%, 而分化不良的肝细胞癌达82.5%, 由此可见, 随着恶性肿瘤组织分化的不同, P-gp、p53的异常表达和细胞增生也随之发生变化; 同时, 动物实验也指出: 强表达P-gp的小鼠对蒽环霉素的反应不佳, 而强表达p53的小鼠对蒽醌类药物也不敏感[25]. 另外, p53表达异常在HCC中的表达与肿瘤分级有密切相关性[26], 并且在病毒致癌过程中是一个晚期才出现的表现, 且独立于慢性病毒感染的病因学过程.
肝细胞癌在发生发展过程中, 往往伴有异常的性激素表达, 如在肝细胞癌及邻近组织中, 性类固醇前体细胞脱氢表雄烯酮转磺酶(DHEA-ST)表达明显下调, 而且早期单发肝细胞癌较晚期DHEA-ST的下调更为明显. 因而, 学者普遍认为肝细胞癌中DHEA-ST的低表达与其调节肿瘤细胞去分化和演进作用有关. 更深一步的研究将目光集中在EBAG9上, 作为一种雌激素应答基因, 其产物和肿瘤细胞表面抗原RCAS1相同, 而肿瘤细胞通过表达RCAS1, 可以抑制T细胞生长, 进而逃脱肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)介导的免疫监视[27]. 有学者对EBAG9/RCAS1在肝细胞癌和正常肝组织中的表达水平进行对比研究后发现[28], 在正常肝组织中, EBAG9/RCAS1呈现稳定的低表达, 其产物均匀分布于胞质中; 在肝细胞癌的细胞膜表面和胞质中, EBAG9/RCAS1的免疫反应则呈阳性. 更重要的是, EBAG9/RCAS1表达增强是和肝细胞癌低分化及更强的增殖活性密切相关, 与肿瘤转移性却无明显相关. 这其中的具体机制仍需要进一步研究. 但是也有学者指出[29]: 肝细胞癌患者血清RCAS1水平并无明显临床价值, 但在胰腺-胆管癌中, 高水平的RCAS1是独立的不利预后因素.
Ⅱ型磷脂酶A2(Ⅱ型PLA2)作为一种具有跨膜结构的胞质蛋白, 在一些代谢途径中起重要的调节作用. 以往曾有研究证实, 在经受手术创伤的患者血清内, Ⅱ型PLA2表现出明显的免疫活性, 而这种免疫反应的动力学和肝脏急性期反应物是相似的. 以此为出发点, Ohshima et al [30]对健康成人、肝细胞癌和肝胚细胞瘤患者肝实质细胞内Ⅱ型PLA2的表达进行了研究, 发现仅有少量健康对照表现出Ⅱ型PLA2的免疫活性, 肝母细胞瘤的细胞内并未发现, 但肝细胞癌患者体内却可以检出不同程度的Ⅱ型PLA2免疫活性, 并且, 随着肝细胞癌分化程度的升高, 这种表达也更加普遍.
HCC的细胞周期、凋亡调节细胞周期循环的引擎分子是细胞周期素和细胞周期素依赖性激酶(CD-Ks), 其中cyclin D是决定细胞周期进程的限制性因子; 而cyclin-CDK复合物的活性由细胞周期素依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinasein-hibitors, CKIs)进行负调控. 迄今为止已鉴定出7种CKIs, 按结构和功能的差异可分为两类: 一类是Ink4 (inhibitor of cdk4)家族, 其中包括p15、p16、p18和p19, 他们均具有特异性抑制cdk4/cdk6-cyclin D复合物的磷酸化酶活性; 另一类是Cip/Kip(CDK-interacting protein/kinase inhibitor protein)家族, 包括P21cip1, P27kip1和P57, 可作用于各种cyclin-CDK复合物. 在HCC中, 已检测到cyclin D1基因的扩增及其表达增强. p16是CKIs中唯一可归为肿瘤抑制基因的成员, 又称多肿瘤抑制基因, 其在HCC中的变化包括缺失、点突变、启动子区的甲基化等, 是目前已知与HCC最相关的CKIs. 杨建民 et al[31]研究了38例肝细胞癌及癌旁肝组织P16和P21蛋白的表达,结果发现P16蛋白的表达缺失率, 在肝细胞癌组织(58%)明显高于癌旁肝组织; 在Edmondson Ⅲ-Ⅳ级肝细胞癌显著高于EdmondsonⅠ-Ⅱ级HCC, 在直径>3 cm HCC显著高于直径≤3 cm早期HCC, 但在有无门脉癌栓组间比较则无明显差别. P21蛋白的表达缺失率, 在肝细胞癌也显著高于癌旁组织. 但在不同分化程度、肿瘤大小及有无门脉癌栓形成组间比较则无统计学差别. 该研究认为, P16蛋白的表达缺失与HCC分化程度及侵袭进展密切相关.
金属硫蛋白(MT)是一组低分子质量, 富含半胱氨酸的胞内蛋白, 其作用为保护细胞免受化学损伤、氧化应激和凋亡的影响以及通过供锌激活转录因子的表达. 自1957年被分离并确定结构后, 一系列研究发现[32], MT在肺癌、结肠癌、肾癌以及睾丸癌中表达均增加, 但在肝细胞癌中其表达却是降低的, 这引起学者们的极大兴趣. 目前的研究认为, MT在肝细胞癌中合成下调与其启动子的过甲基化或p53等肿瘤抑制基因的突变有关. MT在肿瘤自发及获得性耐药性的形成上有一定的作用, 但由于肿瘤耐药性是一个多因子介导的复杂现象, 因此仍需要更多的实验数据对MT在肿瘤进展过程中的作用以及不同肿瘤内表达的差异性进行分析. 与此同时, 有日本学者指出: 在肿瘤进展的不同阶段, MT的同构异型体MT1、MT2浓度有所不同[33]. 而正常肝组织中, MT以Zn-MT形式存在, 但在小HCC(<40 mm)中, MT中的Cu成分明显增加; 在大HCC(>或 = 40 mm)中, MT中Cu或Zn的缺乏十分常见, 但SOD中Cu和Zn成分没有明显差别[34].
在增殖失控的同时, 肝细胞癌还表现为细胞衰老和凋亡程度减轻, 形成永生性细胞, 其发生机制与caspase、bcl-2家族以及p53基因的异常有关, 细胞周期蛋白的过表达也可以缩短肿瘤细胞周期, 加速细胞增殖并降低凋亡[35]. 目前基础研究热点主要集中在基因异常表达对凋亡的调控和蛋白相互作用机制上. 以往的研究表明, 在HCC的多条染色体如1p, 4q, 6q, 8p, 13q和16p上存在高频杂合子丢失(loss of heterozygosity, LOH)[36-38], 与代表错配修复基因通路的微卫星不稳定(MSI)相比, LOH在肝细胞癌形成过程中具有更重要的作用[39]. 而且, 与在出现临床症状之前就已经积累的复发性染色体畸变相比, HCC细胞在转移进展中出现的克隆性演化看起来十分罕见[40]. 张树辉 et al[41]采用毛细管电泳DNA分析系统, 对56例HCC中染色体1p36上10个微卫星的杂合子丢失进行检测. 结果发现, LOH的总频率为69%, LOH以RIZ最高, 其次为D1S199. LOH与血清AFP、HBsAg、肿瘤大小及Edmondson分级和转移等临床病理学参数无明显关系; D1S2893和D1S507基因座, 血清HBsAg阳性患者的LOH频率显著高于HBsAg阴性者; D1S199基因座, 血清AFP阳性者的LOH明显高于血清AFP阴性者; D1S468基因座, 无肝内转移者的LOH显高于肝内转移者. 由此可知HCC在染色体lp36上存在广泛的LOH, 其在HCC的发生和发展过程中起重要作用, 而特定基因座的LOH与临床和病理学参数有一定的相关性. p53作为最早发现的抑癌基因之一, 其失活在肝细胞癌中十分常见, 且与不良预后密切相关. 尽管P53蛋白的定位并不是很确切, 但其对p21和bax基因表达的诱导作用已被证实, 此外, p53还可以诱导CD95蛋白表达上调, 后者使肿瘤细胞倾向于进入Fas配体通路介导的细胞凋亡[42].
张艳玲 et al[43]对细胞凋亡、增殖细胞核抗原(PCNA)、p53和Fas与肝细胞癌临床病理特征关系进行研究后发现, 细胞凋亡指数(AI)、PCNA指数(LI)、p53和Fas表达与HCC患者的性别、年龄及肿瘤大小无显著性差异; AI、P53 和Fas表达与HCC的组织学类型间也无显著差异; LI 与HCC 组织学类型有关: 实体型较梁状型和腺样型明显增高; 随Edmondson分级、TNM分期增加, AI逐渐减少, 而LI及p53表达强度则逐级增高, Fas表达无显著变化. 最终结论是HCC的恶性程度与细胞凋亡指数呈负相关, 而与PCNA指数呈正相关.
肝细胞癌增殖是一个多因子参与的复杂过程, 其中转化生长因子(TGF)-b1的作用一直被人们所重视. TGF-b1作为调节细胞增殖的重要细胞因子, 其行使功能与TGF-bⅡ型受体(TGR2)密切相关. 在Park et al[44]对化学因素导致肝细胞癌的动物研究中发现, 与临近的正常组织相比, 肝细胞癌中TGF-b1转录子轻微增高, TGR2转录子降低. TGF-b1诱导细胞调亡的程度主要与细胞内TGR2的聚集有关, 在癌前病变和肝细胞癌组织中, TGR2表达的下调是导致TGF-b1生长抑制作用丧失的主要原因, 这间接导致肿瘤细胞的克隆性增生. 而NF-kappaB、c-Src激酶以及b1整合素活化的MAP激酶可以抑制TGF-b1介导的细胞凋亡过程, 因此可能在肝细胞癌的发生过程中具有一定作用[45-47].
在肝癌治疗性研究中, 韩国学者[48]发现外周苯并二氮卓受体(PBR)可以诱导细胞凋亡和抑制细胞周期, 前者的作用机制在于PBR能够打破线粒体的跨膜电位、活化caspase-3以及降解细胞核, 同时, PBR可以抑制凋亡抑制蛋白Bcl -2、Bcl-xl的表达, 促进癌细胞凋亡. PBR对细胞周期的抑制作用主要体现在G1/S和G2/M期. 通过对PBR和肿瘤增殖抑制药物紫杉醇、紫杉萜、阿霉素联合应用, 可以获得协同的抗肿瘤作用. 另外, Yu et al[49]对永生化细胞和普通纤维母细胞中MK基因片断的调控活性进行了比较, 发现MK基因片断在永生化细胞中有优先活化自杀基因的作用. E1A基因上游插入MK片断的重组腺病毒(AdMK)在永生化细胞中得到优先复制, 并对其产生细胞毒作用. 在体外实验中, 人肝细胞癌细胞株与普通纤维母细胞相比, 对AdMK更为敏感. 同时, 在感染的纤维母细胞中, AdMK比野生型腺病毒的复制水平要低. 当在小鼠体内肝细胞癌组织中注射AdMK后, 可以发现癌结节生长明显迟缓并伴有细胞凋亡及坏死. 因此, 由MK启动子介导的自杀基因疗法和重组腺病毒疗法可以在对永生系和肿瘤细胞产生细胞毒作用的同时, 将对正常细胞的损伤作用减到最低点. SJ-8026是一种新的哌嗪衍生物, 因其具有拓扑异构酶Ⅱ抑制活性而被作为合成抗癌药物使用[50], 在肝细胞癌体外试验中, SJ-8026可以抑制内皮细胞的血管形成作用并诱导细胞凋亡. 另外, 源于人HCC的Hsp-70肽复合体可以作为一种有效的肿瘤抗原激活树突状细胞(DCs), 后者可以有效的活化特定的抗HCC的T细胞反应[51].
局部侵袭及远处转移是癌组织进行性发展的重要特征, 也是其预后不良的主要原因之一, 研究肝细胞癌复发与转移的相关基因表达和蛋白调控对肝癌预后判断及抗转移治疗都有重要价值, 尽管有越来越多的调控蛋白被发现, 但目前的研究大多数都仅仅停留在对蛋白表达和肿瘤临床病理指标之间的比较研究上, 调控机制的研究进展则相对缓慢. 对肝癌组织标本的分析表明, 许多基因的改变与肝癌的复发转移密切相关. 肿瘤的转移是一个与细胞间、细胞与胞外基质间黏附以及血管新生均相关的复杂过程, 黏附相关基因如整合素a5、CD44、金属硫蛋白酶、uPA等分子都与肝癌的转移密切相关；另外一些基因或蛋白如KAI 1、nm23 -H1、syndecan-1、p27、类肝素酶、galectin-3等也与HCC复发转移相关. 与正常肝组织相比, 肝硬化组织的上皮细胞钙黏蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂因子-1表达明显降低, 但基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-7表达升高, 提示为更有利于肿瘤入侵和转移的环境;Ⅰ级和Ⅱ级肝细胞癌的上皮细胞钙黏蛋白高表达, MMP-3和MMP-9的表达降低. 随着HCC分化程度不断降低, 上皮细胞钙黏蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂因子－2和-3表达不断降低. 这也提示上皮细胞钙黏蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂因子和MMPs可以作为一种预测HCC进展和转移的标记物 [52].
肿瘤血管的形成是肝细胞癌能够得以发展的重要因素, 也是目前研究的一个热点. 当肝细胞癌在肝内转移时, 伴随着动脉网的发展, 可以在窦腔内观察到层黏连蛋白沉积于Ⅳ型胶原上. Torimura et al[53]在肝细胞癌内检出了针对Ⅳ型胶原的层黏连蛋白沉积物: 整合素a1, a2, a3, a6及b1亚单位. 对其功能进行研究后表明: 与单独Ⅳ型胶原相比, Ⅳ型胶原与黏连蛋白的整合增强了肝细胞癌的黏连、移位、化学促动作用, 并促进MMPs的分泌, 这对癌细胞移行、黏附、穿透血管周基底膜有重要作用. 此外, Ⅳ型胶原层黏连蛋白可以明显促进肿瘤周边血管的形成. Zhang et al[54]也指出, b1整合素活化的MAP激酶在转化生长因子b1介导的细胞凋亡中, 具有很强的抗凋亡作用.
与正常的内皮细胞相比, 肝细胞癌血管的内皮细胞缺乏明显的分化标记物. 但Frachon et al[55]对肝硬化和肝细胞癌的内皮细胞CD31, CD34及BNH9表达进行对比后发现, 在肝硬化患者病灶内未检测出这三种血管内皮细胞标记物, 而在不典型增生和肝细胞癌病灶内, 分别有29%和47%可以同时检出三种标记物, 75%的不典型增生结节和100%肝细胞癌病灶至少可以检测出其中一种标记物. 同时, 这3种标记物的表达在肝细胞癌的小细胞成分中较大细胞更常见. 由此可见, CD31, CD34 及BNH9的表达可以作为肝细胞癌发生发展和演进的标记物. 另外, 彭林 et al[56]采用原位分子杂交和免疫组织化学染色方法检测两种促血管生成素Angiopoietin 21 (Ang21)、Angiopoietin 22(Ang22)以及血管平滑肌肌动蛋白在对正常肝脏组织和肝细胞癌组织中的表达进行对比研究后发现: Ang21 mRNA 在正常肝脏和肝癌组织中都有表达, 肝癌组织和癌旁组织与正常肝脏之间差异没有显著意义. Ang22mRNA在正常肝脏不表达, 肝癌组织中阳性表达. Ang22集中于癌灶边缘、血管周围. 肝癌组织中微血管密度和新生血管的数量明显高于正常肝脏. 而且Ang22的表达随肝癌组织病理学分级、有无转移以及新生血管数和微血管密度而增加. 因此, 促血管生成素在肝癌的新生血管形成和转移过程中可能起到一定作用, Ang22可能参与了肝癌的新生血管形成. 血管内皮生长因子(VEGF)是迄今为止发现的最重要的促血管生长因子, 并且是抗血管生成治疗的重要靶分子[57], 他通过增加微血管通透性, 刺激内皮细胞增殖等作用引起肿瘤血管形成, 为肿瘤的生长、转移提供条件. 郝继辉 et al[58]经过检测肝细胞癌中VEGF及其受体flk1、flt1蛋白表达情况, 分析了他们与肝细胞癌临床病理的关系. 实验结果显示肝细胞癌组织中VEGF、flk1、flt1蛋白的阳性表达率均明显高于正常肝组织; VEGF蛋白表达水平越高, 细胞恶性程度及侵袭、转移能力越强, 并且VEGF与flk1/flt1在肿瘤形成过程中具有协同作用. 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是肿瘤血管形成的重要正调节剂, Poon et al[59]将血清中bFGF水平作为肝细胞癌侵袭性和肿瘤切除术后复发指标进行评估, 实验中肝细胞癌患者手术切除前血清bFGF水平在0.22至71.2 ng/L之间, 血清高水平的bFGF和肿瘤体积增大、静脉入侵和高TNM分期相关, 同时还预示着更差的预后. 血清bFGF水平>10.8 ng/L以及瘤体直径>5 cm甚至可作为肝细胞癌术后早期复发的指标. 钙黏蛋白作为adiponectin的唯一受体, 在血管生成过程中扮演了重要角色, 在HCC的肿瘤血管中, 钙黏蛋白仅选择性的在窦状隙内皮细胞中得到表达, 并干扰FGF和adiponectin之间的信号通路, 诱导肿瘤血管形成[60]. 另有学者指出[61]: 在多药耐药(MDR)细胞中, MDR和血管生成素表型相互关联, 同时, Ets-1和c-Met等HGF产物上调和iNOS表达可以加强MDR阳性肝细胞癌细胞的血管生成素活性.
在人类肝细胞癌中, 热休克蛋白27(HSP27)通常有高水平的表达, 他可以同S期激酶相关蛋白2一同在b-1整合素介导的肝细胞癌增殖中发挥作用[62], 并可能是一种潜在的HCC标记物[63]. Yasuda et al[64]通过蛋白印记和免疫组化将肝细胞癌整体HSP27水平、丝氨酸磷酸化(Ser-15, Ser-78, and Ser-82)HSP27水平进行比较研究后发现, 在所观察的所有肝细胞癌病例中都有HSP27的磷酸化现象. 同时, 磷酸化HSP27的表达水平与肝细胞癌肿瘤直径、微血管入侵和TNM临床分期呈负相关. 也就是说, 伴随着肝细胞癌的临床进展, HSP27的表达逐渐下降. 尽管其中的机制尚不明了, 但鉴于HSP27可以干扰细胞凋亡信号的转导并保持线粒体的完整、减少细胞色素C的释放, 磷酸化的HSP27可能对肝细胞癌进展有压制作用. 另有研究表明[65], 尽管在HCC中, 热休克蛋白70(HSP70)的表达略低于HSP27, 但与高Ki-67指数、高肿瘤分期、门静脉入侵和更大的肿瘤体积明显相关, 因此可能在HCC进展中具有更重要的意义.
在HCC中LOH现象十分常见[66], 其中APC, OGG1和DCC位点上的LOH是早期事件, 而p53和RB1位点上的LOH发生在晚期. 较新发现的是位于8p12上的HTPAP基因. 该基因被认为长826 bp, 编码NH2端具有跨膜片断、含175个氨基酸的蛋白, 其表达在转移癌组织较原发HCC组织低很多, 体内和体外试验都提示HTPAP可以抑制HCC的侵袭和远处转移, 当8p发生突变时, 这种作用也随之减弱[67].
肿瘤细胞的黏附性在肿瘤侵袭和转移中都起着极为重要的作用. 首先, 癌细胞从原发瘤中分离就与癌细胞同质黏附降低有关, 在血管内瘤栓的形成及肿瘤细胞游出血管过程与血管内皮及其下基底膜异质黏附都与黏附分子表达改变有关. Endo et al[68]评估了肝细胞癌中上皮细胞钙黏蛋白、a-, b-, g-连环蛋白的表达, 并将其与肝细胞癌分级、临床病理学指标和患者存活率相比较后指出, 与正常肝组织相比, 癌灶中上皮细胞钙黏蛋白的表达下调, 然而a-, b-, g-连环蛋白的表达明显上调, 并与癌组织的分化等级呈正相关. 与此同时, 实验还发现了存在于g-连环蛋白高表达和卫星病灶以及b-连环蛋白高表达和瘤组织血管入侵之间两对明显的正相关关系. 通过对比研究患者存活率, Endo et al发现, 伴有上皮细胞钙黏蛋白、a-连环蛋白低表达和b-连环蛋白高表达的肝细胞癌患者预示着预后不良; 内皮细胞选择素是另一类比较重要的细胞因子, 与其配体sLeX在肝细胞癌的转移中扮演了重要角色. Zhang et al[69]对肝细胞癌灶中内皮细胞选择素及其配体sLeX的表达进行研究后指出, 内皮细胞选择素在伴有癌栓或卫星灶的肿瘤内较没有癌栓或卫星灶的明显上调, 这种改变与肿瘤大小、有无被膜、AFP含量以及分化程度无相关性. 此外, 肝癌组织中CK19[70], osteopontin[71], 谷氨酰胺合成酶以及癌旁组织中COX-2的高表达也和肿瘤的复发转移呈正相关.
基质金属蛋白酶MMPs是迄今发现的与肿瘤侵袭转移关系最为密切的蛋白水解酶, Ozaki et al[72]采用RT-PCR技术对肝细胞癌中MMPs表达进行分析, 并对细胞生长因子HGF、c-Met受体和细胞因子Ets的活性进行检测后发现, 在mRNA水平上, MMP-1, -3, -7在肝细胞癌中呈过表达状态, 然而MMP-2, -9却没有这种相关性. 特定的MMPs由HGF经由转录因子Ets-1通路诱导, 在肝细胞癌中过表达, 这条通路在肝细胞癌侵袭过程中起了重要作用.
每一次技术的创新, 都会给医学基础研究带来突破. 如目前利用基因芯片的方法检测肝癌组织中的基因表达谱, 既可用来发现新的肝癌相关基因, 进而指导肿瘤分子分型和分期, 为预后提供更精确的依据. 通过最大限度的收集基因表达信息, 比传统的差异显示及消减杂交等技术能发现更多新的相关基因[73]. 作为后基因组计划的蛋白质组学也已应用于肝癌的研究, 通过大规模分析蛋白质表达谱以及蛋白质间的相互作用, 揭示细胞内所有蛋白质组份及其动态变化规律, 通过比较不同肝癌组织或结合LCM(激光显微切割)技术比较同一肝癌组织不同来源肝癌细胞的蛋白组学差异, 从而发现与肝癌复发和转移相关的蛋白, 为判断预后及治疗提供新的方法[74]. 此外, 蛋白指纹技术已经用于肝细胞肝癌的早期诊断研究, 我们的初步结果表明肝细胞癌患者与正常人血清中存在至少13种差异表白, 以其中两种标志蛋白(13 752 kDa与11 472 kDa)构建的诊断模型, 对于肝癌的诊断特异性和灵敏度为均高于传统的甲胎蛋白等临床检测技术. 这些新技术的应用, 必将在肝细胞癌病理研究及临床治疗中具有更广阔的前景.
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一, 我国每年新发病例约占全球的45%, 已成为世界上肝癌发病最集中的地区. 经过近半个世纪的努力, 我国医务工作者在肝癌的防治上已取得了举世瞩目的成绩. 但肝癌发生发展迅猛、复发率和转移率很高, 要提高肝癌患者生存率应加强肝癌的基础研究, 促进肝癌早期诊断技术和生物治疗的发展.
肝癌研究热点主要集中在肝炎病毒感染、细胞凋亡、癌基因和抑癌基因与肝癌的关系、肝癌演进的分子机制、细胞因子在肝癌发生发展中的作用等方面.
本文介绍了肝细胞癌发生发展过程中一些细胞因子的异常表达及其相互关系, 内容丰富, 新颖, 能反映涉及到的肝细胞癌基础研究的前沿进展,具有先进性,文字流畅,可读性强.
电编:李琪 编辑:潘伯荣
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