乙型肝炎核心启动子的研究进展

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)与病毒复制、转录及疾病的关系密切, 近年来国内外对核心启动子的结构、功能进行了广泛的研究, 但目前研究的热点集中在核心启动子变异后的生物学活性改变以及与治疗的关系等方面, 本文就其研究进展作一综述.

关键词: 乙型肝炎病毒; 核心启动子

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 31, 2004
Revised: January 1, 2005
Accepted: January 3, 2005
Published online: April 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害人类健康的致病因子, 能够在肝细胞中持续复制、反复感染. HBV的感染除引起急慢性乙型肝炎和肝硬化外, 还与肝癌的发生有密切关系[1]. 核心启动子(CP)及其变异与乙型肝炎病毒致病性以及抗病毒治疗密切相关, 为此国内外学者进行了大量的研究, 并取得了一系列的进展.

1 乙型肝炎病毒核心启动子的基因结构及功能

乙肝病毒核心启动子在1643-1849 nt, 大约在转录开始处上游200 bp内, 结构和功能都十分复杂. CP与X基因的3'-末端(-1837 nt)、C基因前-区的5'-末端(1814 nt)重叠; 增强子II(1687-1775 nt)和DRI(1826-1836 nt)完全在CP区域内. CP调节核心蛋白、前核心蛋白和病毒DNA聚合酶的表达[2]. 核心启动子包括基本核心启动子(BCP)和上游调节区域(URR)两部分, 指导两种长为3.5 kb mRNA的转录, 起始位点仅相差30 nt: 前核心(pre C)mRNA和前基因组(Pg)RNA. 较长的前核心RNA编码产生前核心蛋白, 经信号肽酶和高尔基体中的蛋白酶加工形成成熟的e抗原(HBeAg)分泌到细胞外. 较短的前基因组RNA翻译产生核心抗原(HBcAg)和P蛋白, 同时也是HBV DNA复制时的模板, 被P蛋白识别包装入核心颗粒, 经逆转录产生子代DNA. BCP在1742-1849 nt区段, 包含DRⅠ区、前-C和C基因的2种mRNA的起点; BCP区段中没保守的TATA盒结构, 但在相应位置含有类似TATA盒样的DNA序列结构及转录起始元件, 这对于前C m RNA(1785 nt)和前基因组-C/P mRNA(1820 nt)转录的精确起始是必须的. 上游调节区域包含负调节元件(NRE)和核心上游调节序列(CURS). CURS中含2个重复序列(1668-1684 nt), 是肝细胞核因子的结合部位, 他由正性调节序列和负性调节序列两部分组成. 前者位于BCP的5'-端, 通过位置与方向依赖性方式正性调节BCP, 使BCP活性提高200-2 000倍, 后者位于CURS远端, 按其功能划分为α、γ、β三个亚区, 通过非方向依赖性方式抑制BCP的活性. 根据功能不同, CURS分为A、B两区, 二者彼此独立但相互协同调节着BCP的功能. 此外, CURS区域又划分为数个不同的小区域, 分别命名为α、δ、γ、β盒, 其中盒α、β与HBV增强子II结构与功能密切相关[2-5].

各种肝内富含的和独有的转录因子的协同相互作用对于CP在肝脏的特异性表达是必要的. 如以一种在大多数细胞中都有功能的金属硫蛋白(metallothionein)启动子代替CP, HBV DNA即可在一种人的非肝细胞系HeLa细胞中表达. Lopez-Cabrera et al[6]指出从老鼠肝细胞核提取物纯化的CCAAT/增强子结合蛋白(C/enhancer binding protein, C/EBP), 是一个肝脏特异性的核因子, 在CP上至少结合了5个位点, 而其中的3个位点与增强子Ⅱ重叠. C/EBP在一定程度上激活了CP低浓度的表达, 但在高浓度反而抑制其表达. HNF4在增强子Ⅰ/X基因启动子区有1个结合位点, 另2个结合位点则位于CP区内[7]. 尽管HNF4与前面位点结合, 但其对病毒的转录无明显影响, 而另外两个位于BCP的位点都独立介导HNF4依赖的转录活性[8]. Guo et al[9]通过共转染HeLa细胞系发现HNF4可以与CURS作用而激活CP. 同时却发现, 在HeLa细胞中HNF4结合位点的上游序列区可以抑制HNF4的活化, 而在HuH-7肝细胞瘤细胞中却无此作用. 因此认为, CP的肝细胞特异性是因为至少一种肝细胞富含因子的上调作用与一些存在于非肝细胞内的因子的抑制共同作用的结果. Gilbert et al[10]作DNA-蛋白结合分析时发现, CP包含两个高亲和力的甲胎蛋白转录因子(FTF)结合位点, 与其他受体共用的三个低亲和力结合位点, 转染HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5肝细胞瘤后, 使用带有病毒启动子的氯霉素乙酰基因报告酶(CAT)分析, 无论是否与增强子I连接, FTF都是CP的潜在激活因子, 其活性比HNF4α、HNF3α、HNF3β、C/EBPα更强. FTF结合位点的定点突变提示FTF直接激活CP和为了在CP和增强子I之间产生相互作用而应用了两个高亲和力位点. 共表达分析进一步说明对于共激活前基因组CP, FTF和HNF4α最有效的方式, 这可以基本上解释HBV嗜肝性和感染后早期病毒的复制. 另外, 还有多种转录因子例如Sp1、TATA结合蛋白, 以及一些核受体超家族成员PPARα、RXRα、COUP-TF1和ARP1可以和CP结合, 调节前C RNA和核心RNA的表达[11].

2 乙型肝炎病毒 CP的变异的生物学活性

HBV DNA的复制由前基因组RNA中间体反转录为负链DNA, 由于反转录是利用病毒本身的DNA聚合酶进行的, 该酶缺乏校对活性, 发生变异后难以修正, 造成复制过程中反转录失真. HBV的变异广泛存在于基因组的不同部位, 有些区段高度保守, 是病毒复制十分关键的序列, 这些部位一旦发生变异, 常有重要的生物学活性的改变.

2.1 点突变及其生物学意义

CP区变异并非独立的突变位点, 常是多位点变异的组合. 变异涉及前-C mRNA(1790±1 nt)起始位点上游28 bp富含AT的TTAAA序列(1758-1762 nt), 而前基因组RNA起始位点(1818 nt)上游23 bp的ATAAATT序列(1789-1795 nt)仍然完整[12]. 用于前-C和前基因组RNA合成的启动子元件不同, 是分开调节的. 变异多发生于HBV基因组1750到1770 nt之间, 双变异1762 nt的A→T和nt1764的G→A是最常见的.

Buckwold et al[13]研究显示变异株减少了前-C mRNA的转录和HBeAg的合成, 前-C基因表达的减少却伴随病毒复制的增加, 病毒基因组的复制是原来的两倍, 结果提示BCP双变异抑制但并不能终止HBeAg的表达. Parekh et al[14]从A型HBV患者中克隆了HBV基因的全序列, 12例高病毒水平样本的都是野生型CP, 而43例低病毒水平样本中有37例存在CP变异. 分别转染HepG2细胞, 6例CP变异株存在高水平复制, 这6例CP变异株都出现了1762/1764 nt变异和T1753C、C1766T变异或二者兼有, 而野生株病毒复制水平较低. 结果提示, 是CP的变异而不仅仅是1762 nt和1764 nt位点的改变导致了病毒复制和HBeAg表达的改变. 从中国、日本和希腊[15-17]等国暴发性肝炎(FH)和肝细胞癌(HCC)的患者血清分离物中, 还检测出了与A1762T/G1764A变异同时存在的1753-1757 nt内的变异. ALT水平的增高和肝组织病理的改变都表明, 该区的变异与肝脏病变有密切关系, 变异增强了HBV DNA的复制能力, 其可能机制为[18-20]: (1)A1762T/G1764A及其他BCP点突变, 可能改变由1742-1847 nt形成的pgRNA二级结构, 1753T→C/G变异使1751-1757 nt形成的茎襻结构松散, 使茎襻结构在逆转录中容易打开; (2)可能改变转录因子HNF4和COUP-TF结合位点的位置, 可能产生转录因子HNF1和HNF3结合位点, 上调pgRNA转录; (3)上调核心蛋白的表达和下调前-C蛋白的表达从而加强衣壳化, 使病毒复制增加. Li et al[21]在研究双变异抑制前基因组RNA转录时发现, 双变异不但改变核受体结合位点, 而且还新增加了一个HNF1转录因子结合位点. 进一步转染Huh7细胞提示改变核受体结合位点对HBV RNA的转录没有影响, X蛋白上两个密码子的改变抑制前-C和核心RNA的转录, HNF1转录因子结合位点的出现可以恢复核心RNA的水平. 因此认为, 常见的双变异对前-C RNA转录的特异性抑制是多种因素综合作用的结果.

发生CP(A1762T/G1764A)和前-C区(1896 G→A)变异的HBeAg阴性的患者远多于HBeAg阳性的患者. CP变异的患者更易出现肝脏的失代偿[21-23]. 由于BCP与X基因的部分重叠, A1762T/G1764A导致X基因第130和131的密码子改变, 而这正是肝癌患者经常出现的[24]. Huy et al[25]在研究中发现, CP变异, 特别是T1762/A1764双变异, 与肝硬化、肝癌、基因C型相关(P<0.05). Yuen et al[26]通过多中心研究, CP变异与肝癌存在相关性, 而与基因C型无关. 但对CP变异与肝硬化之间的关系还存在不同的观点. Yuen et al[27]在比较前-C区、CP变异、基因分型与乙肝肝硬化相关并发症之间的关系时, 认为以上因素无明显相关性.

2.2 缺失、插入突变及其生物学意义

碱基缺失作为CP区内的另一种突变形式常见于慢性乙型肝炎患者、肝细胞癌患者、原位肝移植患者体内. 单独感染该种变异病毒株的患者常表现出较低水平的病毒血症. 考虑这种缺失变异可以减弱或阻止前-核心mRNA的起始转录, 从而使HBeAg分泌减少或消失. 这是变异是HBV在宿主长期的免疫压力下发生的, 其出现可能与慢性肝炎患者体内病毒活动性的增强有关.

在慢性乙型肝炎患者和曾接受原位肝移植患者的BCP还可见另一种变异: 插入突变[28]. 这种变异通常出现在肝衰竭之前或与之同时出现, 发生插入突变的病毒常表现出较高的复制能力. 可能是由于插入片段产生了新的TATA结合蛋白的结合位点, 从而导致了重型肝炎或肝衰竭的发生, 这种推测仍需进一步实验证实.

3 乙型肝炎病毒CP的变异与治疗的关系

在HBeAg阴性的慢性HBV感染患者中经常发现基本启动子(A1762T/G1764A)与前-C区(G1896A)变异. 但是, 对于这些变异的临床意义以及与治疗的关系仍存在不同的观点.

Zampino et al[29]R治疗14例在化疗中感染HBV的肿瘤患者, 对α-2 a干扰素产生应答者为6例, 其中有5例患者除A1762T/G1764A外, 还存在T1753C变异, 但是无G1896A变异, 认为干扰素介导的HBeAg血清转换与CP变异相关. Marrone et al[30]使用α-2 a干扰素治疗HBeAg阳性的CP变异(A1762T/G1764A)的患者, 认为血清HBeAg和HBV DNA的低水平与CP的变异存在相关性, 能对干扰素的治疗产生应答, 可以作为干扰素治疗产生应答的一个预测指标. Zhang et al[31]在治疗HBV感染时发现, 17例中的5例A1762T/G1764A变异患者全部产生应答, 而其余只有2例产生应答. 另外5例前-C区G1896A变异及2例合并C区107-118氨基酸变异的患者, 有4例对干扰素的治疗无应答. 结果说明, CP变异可以作为预测干扰素治疗效果的因素之一. Erhardt et al[32]研究了BCP、CURS、NRE和前-C区与干扰素治疗效果的关系, 对干扰素持续应答率约为30%, HBeAg阳性与阴性之间无显著差异. 干扰素应答与BCP变异位点, 特别是1753-1766 nt和1762-1764 nt相关. 在HBeAg阳性患者中, 具有A1762T/G1764A变异以及BCP 的1753-1766 nt内变异点的数目多时, 对干扰素的反应良好. 在HBeAg阴性患者中, 无A1762T/G1764A变异以及BCP的1753-1766 nt内变异点的数目少时, 对干扰素的反应良好. 但是Hannoun et al[33]经过对26例HBeAg阳性的患者12 wk的干扰素治疗, 认为CP特异位点的变异或变异的数量与对干扰素治疗应答的效果无相关性. Chen et al[34]在研究使用α干扰素治疗对HBV聚合酶、BCP、前-C/C特异性变异的影响时, 没有发现与临床应答或治疗结果相关的变异. 同时, 也没有发现与拉米夫定耐药有关的变异, 提示拉米夫定治疗可能对干扰素α无应答的患者有效. Suzuki et al[35]发现在使用拉米夫定治疗5 a的患者, 一部分前-C区和CP的变异患者在1 a之内, 野生株重新变为优势株. 因此认为, HBeAg缺失的患者对拉米夫定治疗的应答较好.

4 HBV CP研究展望

CP在HBV的复制及致病机理等方面都起着重要作用, 并与抗病毒治疗的疗效有关. 但有关CP变异与肝脏病变的关系, 野毒株与变异株的动态变化情况, 不同变异株之间的相互关系, 以及变异与治疗的关系, 还存在许多不同观点, 有待于进一步研究.

备注

编辑: 张海宁

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