慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞IFNAR2 mRNA的表达

摘要

目的: 探讨慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)干扰素-α/β受体(IFNAR2)mRNA的表达, 及其与干扰素(IFN)抗病毒疗效的关系.

方法: 密度梯度离心法分离26例慢性丙型肝炎患者PBMCs, RT-PCR法扩增IFNAR2 mRNA, 计算其表达水平.

结果: 慢性丙型肝炎患者PBMCs IFNAR2 mRNA表达显著高于健康对照者; 其表达与血清病毒载量、病毒基因型及PBMCs HCV-RNA无关; 干扰素治疗完全应答组PBMCs IFNAR2 mRNA表达显著高于部分应答及无应答组.

结论: PBMCs IFNAR2 mRNA表达与干扰素疗效相关, 可作为一个独立因素, 用于预测慢性丙型肝炎患者干扰素疗效.

关键词: 无

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: February 14, 2005
Revised: March 1, 2005
Accepted: March 10, 2005
Published online: April 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

干扰素(IFN)是目前用于慢性丙型肝炎抗病毒治疗的首选药物, 能抑制病毒复制, 降低血清ALT水平, 减轻肝组织炎症及纤维化程度[1-2]. 但IFN治疗慢性丙型肝炎的有效率仅为30%-50%, 且有一定副作用. 因此, 临床上选择能预测IFN疗效的指标极为重要. 已有报道HCV感染者肝组织内有Ⅰ型干扰素受体的表达, 且其表达水平与干扰素疗效呈正相关[3-6]. 同时, 慢性丙型肝炎患者肝组织与外周血单个核细胞(PBMCs)中IFNAR2 mRNA的表达情况呈正相关[7]. 我们应用RT-PCR方法检测了26例慢性丙型肝炎患者PBMCs IFNAR2 mRNA的表达, 进一步分析了IFNAR2 mRNA表达与干扰素疗效的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

26例慢性丙型肝炎患者, 年龄11-60岁(平均43.5), 男20例, 女6例. 治疗前丙氨酸转氨酶(ALT)为正常值的1.5倍以上, 血清抗-HCV阳性, HCV RNA阳性, 无同性恋者、静脉药瘾者, 无甲、乙、丁、戊型肝炎病毒及HIV感染标志者、无抗核抗体阳性者, 排除近3 mo应用糖皮质激素、干扰素等影响免疫功能药物者. 诊断符合2000-09中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案[8]. 另取15名无肝炎病毒感染的健康志愿者做正常对照. 所有患者接受IFNβ-1 a治疗, 用法为44 mg隔日皮下注射, 疗程为24 wk. 治疗结束时血清ALT正常, HCV RNA阴性者为完全应答(CR); 血清ALT正常, 而HCV RNA阳性者为部分应答(PR); 血清ALT未降至正常, HCV-RNA阳性者为无应答(NR). Trizol RNA提取试剂(美国Gibcobrl公司); AMV Reverse Transcriptase(美国Promega公司); Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、PCR应用试剂及丙肝病毒PCR检测试剂盒(华美生物工程公司).

1.2 方法

1.2.1 引物: 引物设计参照文献[9], 序列如下: IFNAR2 mRNA: 上游引物: 5'-GCTTTTGAGCCAGAATGCCT -3'(nt329-348); 下游引物: 5'-CCCTCTGACTGTTCTTCAATG-3'(nt833-853). 产物预测长度525 bp; G3PDH mRNA: 上游引物: 5'-ATTCAAGGCACCGTCAAGG -3'(nt166-185); 下游引物: 5'-GGGCCATCGATAGTCTTCTG-3'(nt554-573). 产物预测长度408 bp.

1.2.2 PBMCs I FNAR2 mRNA检测: 采4 mL肝素抗凝血, 密度梯度离心法分离PBMCs, -70℃保存. Trizol RNA提取试剂提取总RNA, -30℃保存备用. RT-PCR方法检测IFNAR2 mRNA表达, 以G3PDH mRNA表达作为内参照.30 μL反应体系包括: 10×Buffer 3 μL(500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)、1.0% Triton X-100、15 mmol/L MgCl2), 各0.2 μmol/L 3-磷酸脱氧核苷(dNTP), AMV Reverse Transcriptase 3 U, Taq DNA聚合酶 2 U, RNA酶抑制剂20 U, 上、下游引物各1 μL(20 pmol/l), RNA模板3 μL. 反应条件: 37℃逆转录30 min, 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 56℃退火45 s, 72℃延伸60 s, 35个循环, 72℃末延伸7 min. 将PCR扩增产物置于20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 结果置于凝胶成像分析系统上分析.408 bp条带为G3PDH mRNA扩增产物, 525 bp条带为IFNAR2 mRNA扩增产物. IFNAR2 mRNA表达水平 = IFNAR2 mRNA光强度值/各自G3PDH mRNA光强度值.

1.2.3 PBMCs H CV-RNA检测: 总RNA同时进行HCR-RNA的检测. 检测方法按照丙肝病毒PCR检测试剂盒说明书中的操作步骤进行.

1.2.4 HCV-RNA定量及HCV基因分型检测: 采患者治疗前血清100 μL, 分别用于HCV RNA定量及HCV基因分型的检测. HCV RNA定量应用Bayer HCV kits; HCV基因分型应用Bayer Lipa assay.

统计学处理 应用SPSS软件. 应用²检验、方差分析、Pearson相关分析和多因素Logistic回归分析进行统计分析.

2 结果

2.1 RT-PCR检测PBMCs

IFNAR2 mRNA结果(图1)26例慢性丙型肝炎患者中, PBMCs IFNAR2 mRNA阳性者25例(96.2%); 15例对照组中PBMCs IFNAR2 mRNA阳性者5例(33.3%), 丙型肝炎组阳性率显著高于对照组.26例患者中男性、女性PBMCs IFNAR2 mRNA表达值分别为0.7 979±0.3 763、0.8 575±0.2 405, 无显著性差异.

图1 PBMCs IFNAR2 mRNA电泳结果. 525 bp为IFNAR2 mRNA扩增产物, 408 bp为G3PDH mRNA扩增产物. 1: 阳性; 2: 阴性; 3: 空白对照.

2.2 PBMCs IFNAR2 mRNA表达与PBMCs

HCV RNA 26例慢性丙型肝炎患者中PBMCs HCV RNA阳性者21例, 阴性者5例, IFNAR2 mRNA表达值分别为0.784 804±0.2 934、0.8 572±0.2 142, 无显著性差异.

2.3 PBMCs IFNAR2 mRNA表达与血清病毒定量和基因分型

血清HCV-RNA载量取自然对数, 与PBMCs IFNAR2 mRNA表达值进行相关性分析, 结果是二者间无显著相关性(r = 0.133, P = 0.637). 根据对干扰素疗效的不同影响, 将慢性丙型肝炎患者分为1型基因型组14例与非1型基因型组12例, 其IFNAR2 mRNA表达值分别为0.8 049±0.1 999、0.7 799±0.1 896, 无显著性差异.

2.4 PBMCs IFNAR2 mRNA表达与干扰素疗效

治疗结束时完全应答(CR)者10例, PBMCs IFNAR2 mRNA表达值为1.0 624±0.1 633; 部分应答(PR)者7例, 表达值为0.7 977±0.1 549; 非应答(NR)者9例, 表达值为0.6 055±0.2 581. 完全应答组PBMCs IFNAR2 mRNA表达值显著高于部分应答组和非应答组(P<0.05), 而部分应答组和非应答组表达值无显著性差异(P = 0.069).

2.5 对治疗前血清HCV RNA水平、病毒基因型、PBMCs

HCV RNA及PBMCs IFNAR2 mRNA表达值4项因素与IFN疗效间进行Logistic回归分析, 结果显示PBMCs IFNAR2 mRNA表达值对疗效影响较大, 可视为一个独立预测因素.

3 讨论

干扰素受体可分为Ⅰ型受体和Ⅱ型受体.Ⅰ型受体包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω受体; Ⅱ型受体是指IFN-γ受体. 临床上常用IFN-α和IFN-β治疗慢性丙型肝炎, Ⅰ型干扰素受体是IFN-α和IFN-β共用受体[10], 至少由两个亚单位组成, IFNAR1(IFN-α受体)和IFNAR2(IFN-α/β受体), 其结构和机能已经很明确了[11-12]. 就IFNAR1和/或IFNAR2 mRNA在肝脏中的表达情况, 很多学者进行了临床试验研究, 结果显示IFNAR1和/或IFNAR2 mRNA的表达与患者临床表现及病毒基因分型无关, 而与IFN治疗疗效相关. 但人们对肝组织外干扰素受体的表达还知之甚少, 哪些细胞或组织中干扰素受体的表达与肝组织一致, 可以代替肝活检用以推测肝组织内干扰素受体的表达情况呢？PBMCs首先引起了人们的注意, 因为PBMCs是丙型肝炎病毒肝外增殖的重要部位. 已有研究表明慢性丙型肝炎患者肝组织与PBMCs IFNAR2 mRNA的表达情况正相关, 我们进一步证实了PBMCs IFNAR2 mRNA表达与IFN疗效的关系.

本组26例慢性丙型肝炎患者PBMCs IFNAR2 mRNA的表达水平明显高于正常人. Yatsuhashi et al[13]在同时检测急性甲型肝炎、慢性乙型肝炎及非病毒性肝病(脂肪肝)患者肝组织内IFNAR2 mRNA表达时, 发现肝炎病毒感染均能上调IFNAR2基因在肝组织内的表达, 这种上调可以解释为机体对病毒感染的一种反应, 参与机体清除病毒的免疫应答: 机体通过上调IFNAR2 mRNA的表达来提高与内源性或外源性IFN的结合, 从而加强对病毒的清除. PBMCs是丙型肝炎病毒肝外复制的一个重要场所, 故推测HCV感染也能够上调IFNAR2 mRNA在PBMCs内的表达, 与我们的研究结果一致. PBMCs中IFNAR2 mRNA表达增加的机制尚不十分清楚, 可能与某些细胞因子有关. 慢性肝炎患者血清中IFN-γ水平上升[14], 有报告IFN-γ能够调节IFN受体的表达[15]. 本组PBMCs HCV-RNA定性"+"及"-"者, IFNAR2 mRNA表达值无显著性差异, 提示IFNAR2 mRNA的表达与PBMCs HCV-RNA无关, 其表达情况可能不依赖于PBMCs中是否有HCV的持续感染, 而受宿主自身的免疫状况的影响, 这与IFN抗病毒作用机制一致.

IFN分子本身并不具备抗病毒功能, 必须与细胞表面相应受体相结合, 并经过一系列细胞内信号传导, 最终产生抗病毒蛋白而发挥作用, 故与特异性受体相结合是IFN发挥抗病毒作用的第一步[16-17]. IFN发挥生物学效应与其靶细胞上特异性受体的水平有关. 我们检测了26例慢性丙型肝炎患者PBMCs IFNAR2 mRNA表达与IFN抗病毒疗效间的关系, 结果显示完全应答组表达值显著高于部分应答组和非应答组. 这说明IFN抗病毒疗效与PBMCs IFNAR2表达水平密切相关, IFN疗效差-不应答或不能完全应答, 可能与其受体表达不足有关, 进一步推测PBMCs IFNAR2 mRNA表达情况是影响IFN疗效的宿主方面因素. 丙型肝炎病毒基因型[18]及治疗前血清HCV RNA载量[19]是目前公认的影响IFN应答的病毒因素, 而PBMCs中HCV-RNA也被认为是IFN疗效的预测因子[20]. 本实验中, PBMCs IFNAR2 mRNA表达与治疗前血清病毒载量、病毒基因型及PBMCs HCV-RNA无关, 故可作为一个独立因素用于预测IFN的疗效. Logistic回归分析进一步证明了这一结论.

备注

编辑: 张海宁

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