肠上皮细胞紧密连接在肠屏障中的作用研究进展

摘要

肠上皮细胞紧密连接是肠上皮细胞间的主要连接方式, 对维持上皮细胞极性及调节肠屏障的通透性发挥着重要的作用. 因此, 维持完整的肠上皮结构和功能对于保护肠道屏障功能、防止细菌内毒素及毒性大分子物质进入体内具有重要意义. 本文从紧密连接在肠上皮中的生物学功能、分子调控机制及当前研究现状等作综合阐述.

关键词: 肠上皮细胞; 紧密连接; 黏膜屏障

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: January 6, 2005
Revised: January 15, 2005
Accepted: January 20, 2005
Published online: February 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

黏膜屏障是肠道最重要的一道屏障, 他由完整的肠上皮细胞(intestinal epithelial cell, IEC)和相邻肠上皮细胞之间的连接构成, 并调控着水和溶质的跨上皮转运(如单糖、氨基酸、核苷酸、维生素及激素等). 相邻上皮细胞间的连接方式有多种, 如紧密连接(tight junction, TJ)、缝隙连接(gap junction, GJ)、黏附连接(adherence junction, AJ)以及桥粒(desmosome)等. 而TJ是细胞间最重要的连接方式, 其功能是只允许离子及小分子可溶性物质通过, 而不允许毒性大分子及微生物通过, 这种特殊生理功能在肠道屏障的维护中起着举足轻重的作用. 近年来, 对紧密连接蛋白(如Occludin、Claudins、ZOs等)的结构研究取得了一定的进展, 但有关这些蛋白的生物学功能及其在肠屏障中如何发挥作用却知之甚少. 此外, 由严重创伤、外科感染、脓毒症(尤其是肠源性致病菌如梭状芽孢杆菌、大肠杆菌和脆弱类杆菌等细菌感染)等引起TJ发生变化及所致肠黏膜通透性增高, 细菌、毒素移位而发生肠源性感染的机制也未阐明. 这方面的研究为深化肠屏障功能的机制和提升基础科学理论具有重要意义. 同时, 也是临床医师颇为关注得热点问题.

1 紧密连接的生物学功能

1.1 紧密连接的分子结构

现已证明有多种蛋白质参与紧密连接的形成, 根据不同作用可将这些蛋白分为结构蛋白(Occludin, Claudin[1-2], JAM等[3])和调节蛋白(如E钙粘素、肌动蛋白、肌球蛋白、Cingulin等[4]).TJ在超薄切片电镜下表现为细胞膜表面不连续的融合点或吻合点. 冰冻蚀刻电镜下表现为细胞胞质面的连续的吻合线和胞外膜相应的凹槽, 封闭细胞间隙(屏障功能), 并将细胞顶部与基侧部分开(栅栏功能).

诸多紧密连接蛋白中, 尤以Occludin及Claudins最为重要. Occludin为一完整的Ⅱ型跨膜蛋白, 分子质量约65 ku[5], 含四个跨膜结构, 在维持和调节紧密连接屏障功能中具有重要作用. 冰冻蚀刻电镜显示, Occludin位于紧密连接线上. Furuse et al[1]研究发现, 用Occludin转染L-纤维母细胞(缺乏TJ)后, 相邻细胞之间可以形成TJ样纤维. Claudins是Occludin之后被发现又一类参与紧密连接的跨膜蛋白, 也含四个跨膜结构. 冰冻蚀刻电镜技术显示, Claudins是构成紧密连接线的主要成分[6].Claudins在不同时期和不同的组织其表达也不同. ZOs是一种外周膜蛋白, 其三种异构体(ZO1, ZO2和ZO3)均含有由鸟苷酸激酶样(GUK)结构域、PDZ、Src同源SH3结构、酸性结构域等组成的保守序列, 能够与胞质内的其他蛋白如Occludins蛋白的C末端连接, 而ZO1的C末端则可结合肌动蛋白和应激纤维, 从而将Occludin和肌动蛋白骨架系统连接在一起构成稳定的连接系统[7-10]. 连接黏附分子(JAM)为免疫球蛋白超家族成员, 因此在结构上与Occludins及Claudins明显不同, 位于上皮细胞紧密连接处, 体外化学趋化实验或体内炎症反应模型均证实JAM能够限制白细胞穿过TJ处, 表明JAM在炎症反应时白细胞的游出中发挥重要作用. 肌动蛋白位于上皮细胞顶侧连接复合物下形成显著的环状结构[11], 称为周围连接肌动蛋白, 其中含有相当多的肌球蛋白, 通过肌动蛋白结合蛋白与细胞膜相连, 参与紧密连接的调节.

1.2 紧密连接的作用

1.2.1 选择性屏障: 肠上皮细胞TJ作为动态的通透性屏障, 具有双重功能: 阻止潜在的有害物质或病原体进入机体, 同时允许营养物质、离子和水进入体内. 临床研究发现, 高糖饮食时葡萄糖吸收率并不与葡萄糖转运体的增加成正比. 有学者认为, 这是由于营养素能够诱导细胞旁路通透性的增加所致. Madara et al[12]发现, 在肠上皮细胞顶部加入超生理剂量的葡萄糖或色氨酸, 能够增加上述物质的跨细胞旁路转运并降低跨膜电阻抗(TER). 通常情况下, 葡萄糖和氨基酸如色氨酸等是通过肠黏膜上皮细胞的Na+偶联转运体而被吸收入细胞的. 此时, 大量Na⁺和水进入胞质, 胞质中过多的Na⁺通过更多Na^＋-K^＋交换或Na^＋-Ca^2＋交换而恢复正常. 同时, 胞质中Ca^2＋浓度升高, 激活肌球蛋白轻链并使之磷酸化, 从而使肌动蛋白环和TJ相关的细胞骨架收缩, 细胞旁路通透性增加, 其结果必然是经细胞旁路吸收的葡萄糖和氨基酸增多. 还有研究发现, 在病理状态下, 紧密连接蛋白可产生收缩现象, 并向胞质中移动, 细胞孔隙(窗孔)明显扩大, 导致大分子物质及毒素、细菌移位, 此时肠黏膜就丧失其选择性屏障作用.

1.2.2 维持栅栏功能: 已知TJ由围绕上皮细胞顶端的跨膜蛋白(Occludin、Claudins等)构成, 从而限制了以TJ为界的上皮细胞顶侧和基侧膜两部分细胞膜上的脂质自由流动(即栅栏功能). 这两部分的主要区别在于脂质和蛋白质的构成不同[13], 基侧膜的结构和功能与一般的非上皮细胞相似, 而顶侧膜富含鞘糖脂和胆固醇[14], 而磷脂相对缺乏, 鞘糖脂可通过分子之间的H键相互连接, 维护肠黏膜的硬度和不可通透性, 从而保护机体免受细菌、毒素等有害物质的入侵. 研究发现Occludin的显性或隐性变异表达均能够破坏上皮细胞的极性及膜脂流动性, 表明Occludin参与该功能的形成和调控. 也有学者认为此结构对维持蛋白极性具有重要作用, 但当该结构被破坏后, 细胞膜的稳定性即丧失. Ebnet et al认为细胞极性的形成可能与连接黏附分子(JAM)及极性蛋白PAR-3有关[15].

1.3 肠上皮细胞TJ的调控

肠上皮TJ一旦发生变异、减少或缺失, IEC间隙通透性就会增加, 细菌、内毒素及大分子物质可通过TJ进入体循环. 例如某些肠道炎症性疾病如炎症性肠病(IBS), 其特征就是IEC旁路通透性增高[16], 允许肠腔内病原菌及其毒素通过并进入上皮下层, 导致炎性肠病的发生. 此外, 非甾体类消炎药性肠病也被认为是由于细胞旁路对细菌毒素的通透性增高, 中性粒细胞渗出进而产生黏膜下炎症[17]. 另外, M閚閠rier是一种少见的特发性疾病, 表现为累及胃体部的肥厚胃皱襞. M閚閠rier患者的肠黏膜紧密连接的宽度由7.5 nm上升到10.5 nm, 其发病原因可能是由于感染或变态反应, 紧密连接蛋白丢失或水肿导致紧密连接的持续性开放. 目前, 有关这些TJ的调控机制尚不清楚, 但下列这些途径基本形成共识.

1.3.1 磷脂酶C依赖性信号通路: 肠黏膜受到来自外源性刺激如细胞旁路通透性增强剂(PPEs)或内源性刺激, 通过G蛋白的介导, 激活磷脂酶C(PLC), 后者可将磷脂酰肌醇二磷酸分解成二脂酰甘油(DG)和三磷酸肌醇(IP3), 进而激活蛋白激酶C(PKC)同工酶、钙调素依赖性激酶和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)并改变其活性, 诱导周围连接肌动蛋白-肌球蛋白环的收缩. 该环与细胞膜相连, 收缩移位后可松弛紧密连接结构从而改变其功能[18]. 乙醇和中链脂肪酸也可通过上述机制分解周围连接肌动蛋白-肌球蛋白环从而使其移位.

1.3.2 Ca²⁺-E钙黏素信号途径: E钙黏素位于细胞间紧密连接线下方, 其作用依赖于Ca²⁺, 胞外部分形成5个结构域, 均含Ca²⁺结合部位. E钙黏素通过a-、b-、g-链蛋白(catenin)以及黏着斑蛋白(vinculin)、锚蛋白、a辅肌蛋白与肌动蛋白结合在一起, 在维持肠上皮紧密连接屏障功能中发挥重要的作用. 研究表明, Ca²⁺螯合剂(如EDTA)能增加肠上皮细胞紧密连接的通透性, 其机制可能是EDTA消耗细胞外Ca²⁺, 导致E钙黏素所需Ca²⁺减少[19], 紧密连接蛋白(Occludin和ZO1)分解, 细胞旁路通透性增高所致. 此外, 细胞外Ca²⁺减少也可激活细胞内肌球蛋白激酶活性, 周围连接肌动蛋白和肌球蛋白纤维的向心性收缩, 细胞间紧密连接破坏和肠黏膜通透性增加.

1.3.3 酪氨酸激酶-磷酸酶信号通路: G蛋白(Ga₁₂)属异三聚体G蛋白家族, 通过SH₃结构域结合到ZO1, Ga₁₂活化能增强考克斯班尼犬(MDCK)细胞旁路通透性. Meyer et al[20]研究发现, 在表达Ga₁₂活性的MDCK细胞, Src自磷酸化活性增高; 同时b链蛋白酪氨酸磷酸化也升高, 共聚焦显微镜下显示紧密连接蛋白被破坏、ZO1和 Na⁺-K⁺-ATP酶的正常分布发生改变、细胞极性消失, 而肌动蛋白应激纤维增高. 酪氨酸激酶抑制剂金雀异黄素和Src特异性抑制剂PP-2能逆转上述改变, 并可阻止细胞旁路通透性的升高. 因此, Ga12可部分通过Sac酪氨酸激酶通路调控上皮细胞的紧密连接.

1.3.4 Rho GTP酶途径: Rho GTPases 是一类小分子G蛋白酶, 分子质量为20-30 ku, 属于Ras超家族中的一类, 其作用受蛋白激酶的调节. Rho GTPases是周围连接细胞骨架肌动蛋白和肌球蛋白稳定性的重要调节蛋白, 并作为信号分子调节与细胞骨架有关的各种信号转导途径. 研究发现, Rho激活后通过肌球蛋白的磷酸化作用使ZO1和Occludin在紧密连接处沉积, 如抑制其活性后, 则ZO1和Occludin在紧密连接处定位降低; 从而维持紧密连接的功能. 如果抑制Rho活性的同时敲除ATP, 则在转染细胞内可出现更广泛的紧密连接成分的丢失[21]. 对于Rho信号通路如何调节紧密连接蛋白成分的磷酸化目前尚不清楚.

1.4 国内外研究现状

近年来, 随着电镜技术和分子生物学技术的发展, 对TJ的结构和功能研究不断深入(如TJ结构蛋白及其相关基因的筛选验证、细胞、分子水平的调控机制的探讨等), 因此, 对TJ及调节蛋白的生物学功能已有一定的认识. Hopkins et al[22]将小肠上皮细胞(T84)与大肠杆菌细菌毒素坏死因子-1(CNF-1)共同孵育6-8 h, 发现随着Occludin的去磷酸化, 该蛋白也从TJ移入胞质内, 同时肠上皮细胞TER也短暂降低, 肠黏膜通透性增高. 用丝/苏氨酸磷酸酶抑制剂也能阻止大肠埃希菌(EPEC)诱导的Occludin去磷酸化及TER的短暂降低, 表明二者均参与TJ的调节. Tavelin et al[23]研究了含4-40个氨基酸的蛋白肽对Caco-2细胞TJ的作用, 这些蛋白肽来源于Occludin第一个胞外环N末端的肽能增加TJ的通透性. 然而, 这种肽只有在细胞基侧才有作用, 其部分原因是由于顶端肽酶的降解作用以及该肽发生了聚合. Jerrold et al以Caco-2 IEC为模型, 并以Na-葡萄糖转运体(SGLT1)转染该细胞, 发现TER明显降低, 同时小分子物质如甘露醇吸收增加而大分子物质如菊粉并不增加, 表明TJ通透性升高具有选择性. SGLT1转染后Caco-2的TJ通透性升高可被MLCK抑制剂所抑制, 提示MLC磷酸化在TJ中具有重要作用. 进一步研究发现, MLC磷酸化调节IEC通透性的机制可能与Ca^2＋激活MLCK有关, 导致周围连接肌动蛋白基肌球蛋白纤维向心性收缩, ZO1与Occludin分离, 相邻细胞间隙增大[24]. 有学者将大肠杆菌毒素A与IEC共同孵育, 发现其毒素A能促进ZO1的再分布, 从而导致TER降低及TJ超微结构的形态学改变, 细胞旁路的通透性升高. 其机制可能与由蛋白激酶Ca(PKCa)和蛋白激酶Cb(PKCb)介导的IEC顶侧和基底侧F-肌动蛋白的重构有关. 而抑制PKCa和PKCb则能阻止毒素介导的RhoA的糖基化作用、ZO1转位及细胞变圆. 另有学者研究了肠道神经系统ENS对TJ的作用, 发现黏膜下神经元被激活后, 反映IEC旁路通透性的异硫氰酸葡聚糖和菊粉的流量降低, ZO1表达明显升高, 这些作用可被TTX和VIP受体拮抗剂所阻滞, 再用VIP时又可恢复. 我们采用盲肠造瘘建立腹腔感染大鼠模型, 利用透射电镜对脓毒血症大鼠肠上皮细胞TJ研究表明, 感染大鼠肠上皮细胞Occludin表达明显减少, 细胞紧密连接不清, 紧密连接变短变宽, 细菌移位率明显升高. 但这些研究均未能深刻阐明其分子机制及基因对TJ及蛋白功能的调控, 其调控网络也未涉及.

2 当前研究存在的问题

2.1 调控机制不清

迄今为止, 已知至少有16种蛋白参与TJ的调控, 随着研究的深入, 又有新的TJ调控蛋白被发现. 这些蛋白的生物学功能以及相互之间的作用如何尚不清楚. 此外, 基因的表达方式错综复杂, 从mRNA表达水平并不能预测蛋白表达水平, 蛋白质的动态修饰和加工并非来自基因序列. 因此, 除前述途径外, 是否还存在其他调控途径(基因调控途径等), 其调控机制和网络如何, 也未完全阐明.

2.2 研究深度不够

目前的研究大多采用冰冻蚀刻电镜、免疫组化及分子生物学等技术, 对TJ的结构、功能及调控机制的研究尚不够深入. Mankertz et al[25]采用基因组DNA分子克隆、转染和荧光素酶分析法、电泳迁移转变分析及位点定向突变等技术对Wntx信号与Claudin-2的交叉对话进行深入的研究, 发现Wntx信号可与LEF/TCF组成调控网络直接或间接调节Claudin-2基因的表达. 随着基因组计划的实现, 相信在某种程度上为认识TJ调控的分子机制提供基础. 此外, 近年来, 为学者们所重视的蛋白组学和代谢组学技术为解决上述问题提供了可能, 如采用双相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索等拟可完整解决TJ调控机制问题.

2.3 临床研究受限

肠黏膜TJ的结构和功能在体外实验和动物模型方面已取得巨大进步, 并为临床应用提供了更为有力的实验依据. 体外实验常用的模型是Caco-2细胞模型, Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞, 与小肠吸收细胞有许多相似之处, 如微绒毛、细胞间连接、酶及营养物转运体等, 虽然该模型容易采用常规的方法就可对TJ的结构和功能进行量化分析, 如TER和示踪剂的跨膜转移等. 但由于人体肠道内的环境远较体外复杂, 不仅受到肠腔内多种微生物的影响, 而且收到来自神经、体液、内分泌功能的影响. 另一方面, 人体IEC的紧密连接其调控机制也较体外模型复杂的多. 此外, 用于检测肠黏膜通透性得示踪剂如壳聚糖等其生物活性与其毒性很难分开, 以及医学伦理等问题均限制了临床研究的展开.

2.4 防治针对性不强

随着肠上皮细胞TJ生物学功能研究的深入, 对TJ的防治研究也渐受到许多学者的重视, 但大多缺乏针对性. 谷氨酰胺在维持肠上皮细胞屏障功能中具有重要作用已为大多数学者所接受, 但其机制仍不十分清楚. 如肠道或静脉内给予谷氨酰胺, 可维持肠黏膜的完整性及降低异常增高的通透性, 肠黏膜细菌移位率明显下降. 而肠道内给予谷氨酰胺合成酶抑制剂甲硫氨酸亚砜(MS)则可加重肠黏膜的损害. 益生菌(乳酸杆菌、双歧杆菌等)促进肠上皮的增生作用已得到大多数学者的共识, 很多研究证实了这方面的作用[26], 一些学者[27-31]将人小肠上皮细胞株(HT29/C1.19和Cao-2)与经致病性大肠杆菌(EIEC029: NM)处理后与原生菌共同孵育, 发现被EIEC感染的小肠上皮细胞TER明显下降, 细胞间黏附明显抑制, 细胞骨架丝状裂解, 紧密连接磷酸化; 原生菌组则逆转了这些改变, 维护了细胞骨架和ZO-1蛋白及Occludin表达, 对表皮生长因子(EGF)刺激作用增强. 我们对脓毒症大鼠持续5 d肠内灌注一定剂量的乳酸杆菌, 研究表明, 能明显减少外周血内毒素含量, 维护肠道黏膜屏障, 增加回肠和结肠sIgA的分泌及上皮细胞紧密连接蛋白Occludin表达, 紧密连接超微结构完整, 粪便基因指纹图谱分析显示肠道菌群紊乱程度明显减轻, 但有关深层次的详细机制仍不清楚.

3 展望

随着研究的深入, 一些TJ相关的蛋白相继被发现, 他们的功能也逐渐被认识. 而更重要的是, 我们不仅要研究TJ相关的蛋白分子之间的相互作用, 还要研究这些分子与其功能之间的关系. 如最近研究发现, Occludin参与调控上皮细胞转化的信号转导, 以及TJ相关的转录因子控制原癌基因的表达等, 均表明对肠上皮TJ的完整理解必须包含对细胞生长和分化的决定因素的分析. 可以相信, 不久的将来, 随着激光共聚焦显微镜、磁共振波谱技术的发现和应用来检测TJ蛋白的分子运动及构象; 如采用基因芯片的寡核苷酸微阵列杂交, 通过扫描荧光信号强度分析各基因组mRNA表达量的情况以及高通量、高灵敏度、高分辨率和重复性好的蛋白组学等研究, 希望能较全面地评价TJ蛋白在肠上皮细胞受损时的生物学功能变化及各种因素对TJ蛋白调控作用的分子机制.

备注

编辑:张海宁

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