内源性一氧化氮对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜通透性的影响

摘要

目的: 探讨内源性一氧化氮(NO)对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肠黏膜通透性的影响.

方法: 84只Sprague-Dawley大鼠随机分为4组: 假手术组, 生理盐水组(ANP/NS), 硫酸甲基异硫脲组(ANP/SMT), 精氨酸组(ANP/L-Arg). 测定12 h和24 h 血浆和小肠黏膜组织NO含量, 观察小肠的病理改变, 肠黏膜通透性以及脏器细菌移位率.

结果: ANP大鼠病程中存在NO含量降低、肠黏膜损伤, 出现肠黏膜通透性升高和细菌移位, 应用SMT可使NO的含量更加减少, 肠黏膜损伤更加严重, 肠黏膜通透性和脏器细菌移位率显著增加; 应用左旋精氨酸(L-Arg)后小肠的病理损害明显减轻, 肠黏膜的通透性显著降低, 脏器细菌移位率显著减少.

结论: ANP大鼠病程中存在内源性NO水平降低, 肠黏膜通透性升高, 适当调节内源性NO的水平对降低ANP肠黏膜通透性具有一定的保护作用.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: November 9, 2004
Revised: December 2, 2004
Accepted: December 8, 2004
Published online: February 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

肠黏膜通透性的改变乃至细菌移位是急性坏死性胰腺炎(ANP)重症化的主要原因之一. 我们观察了ANP大鼠肠黏膜组织一氧化氮(NO)含量及肠黏膜通透性的改变, 以探讨NO对ANP大鼠肠黏膜通透性的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

84只Sprague-Dawley大鼠由东南大学医学院实验动物中心提供, 体重160-200 g, 平均体重185.6 g. 牛磺胆酸钠、L-精氨酸(L-Arginine, L-Arg)、硫酸甲基异硫脲(Sulpha-Methylisothiourea, SMT)均为Sigma公司产品. NO检测试剂盒为南京建成生物工程公司产品, 锝(99mTc)为中国原子能科学研究院同位素所产品.

1.2 方法

1.2.1 实验分组及模型制备: 84只大鼠随机分组, 假手术组12只, ANP实验组72只; ANP组再分为生理盐水组(ANP/NS), 硫酸甲基异硫脲组(ANP/SMT), 精氨酸治疗组(ANP/L-Arg), 各组再分为12 h组24 h组, 每组12只. 参照Aho et al[1] 的方法制备急性坏死性胰腺炎模型后, 于近端空肠缓慢注入1.5 mCi ^99mTc-DTPA. 制模后10 min, 每12 h腹腔内分别缓慢注射生理盐水或0.5 g/L的 SMT或15 g/L 的L-Arg 1.0 mL/100 g体重. 放入代谢笼, 留取尿液. 假手术组大鼠, 仅提起十二指肠, 轻轻翻动胰腺三次. 各ANP组分别于12 h和24 h处死采取标本, 假手术组24 h处死采取标本.

1.2.2 观察指标及检测方法: 病理学: 腹腔内大体改变, 末段回肠石蜡切片, 观察组织学改变, 回肠黏膜上皮电镜, 观察肠黏膜上皮细胞超微结构改变; 肠黏膜通透性: 放免计数器检测尿^99mTc-DTPA脉冲数[2]; 血浆和肠黏膜组织NO含量: 取血浆和回肠黏膜组织匀浆用硝酸还原酶法检测NO含量; 腹腔脏器细菌移位率: 取胰腺、腹水、肠系膜淋巴结(MLN)、下腔静脉血作细菌需氧和厌氧培养, 计算脏器细菌移位率.

统计学处理 采用SPSS10.0软件处理, 计量资料采用t检验, 以mean±SD表示; 计数资料采用χ²检验. P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 病理改变

假手术组大鼠腹腔内无腹水, 胰腺和肠管未见明显异常改变; 大鼠腹腔内可见较多血性腹水, 肠系膜、大网膜出现大量皂化斑, 胰腺可见充血水肿、出血坏死灶及皂化斑, 结肠及小肠管壁充血水肿, 部分肠管内可见血性内容物; ANP/SMT组胰腺和肠管病变较ANP/NS组改变更加严重; ANP/L-Arg治疗组大鼠腹腔内可见少量淡黄色腹水, 肠系膜、大网膜可见少量皂化斑, 胰腺可见轻度充血水肿及皂化斑, 肠管壁轻度水肿. 光镜下观察: 假手术组肠黏膜无异常; ANP/NS组大鼠肠黏膜水肿、黏膜上皮变性、坏死、脱落, 黏膜及黏膜下层可见血管扩张、出血及炎症细胞浸润; ANP/SMT组肠黏膜破坏更加严重, 表面被覆假膜; ANP/L-Arg治疗组大鼠肠黏膜轻度水肿, 黏膜及黏膜下层血管扩张充血及炎症细胞浸润减轻. 电镜下见肠微绒毛坏死、脱落, 线粒体肿胀, 细胞紧密连接破坏, 且随着时间的延长而加重; ANP/SMT组肠微绒毛坏死、脱落加重, 线粒体显著肿胀, 与ANP/NS组大鼠比较细胞紧密连接破坏更加严重; ANP/L-Arg治疗组肠微绒毛轻度坏死、脱落, 线粒体轻度肿胀, 细胞紧密连接破坏减轻.

2.2 血浆NO含量的测定值(表1)

表1 血浆NO的测定值(mmol/L).

组别	12 h	24 h
假手术组成		15.25±0.7634
ANP/NS组	11.48±0.9593ac	8.94±0.6529ae
ANP/SMT组	11.25±0.7013ac	7.59±0.2937ae
ANP/L-Arg组	15.16±1.0190	16.32±0.7433

^aP<0.05 vs 假手术组,

^cP<0.05 vs ANP/L-Arg 12 h组,

^eP<0.05 vs ANP/L-Arg 24 h组.

结果表明, 胰腺炎大鼠存在NO含量减少, 应用NO阻断剂SMT后血浆NO含量降低更加明显, L-Arg可以显著提高血浆中NO的含量甚至达正常水平.

2.3 肠黏膜组织NO含量的测定值(表2)

表2 各组大鼠肠黏膜组织NO含量的变化(mmol/g蛋白).

组别	12 h	24 h
假手术组		3.27±0.3089
ANP/NS组	2.08±0.2209ac	1.39±0.1655ae
ANP/SMT组	2.19±0.4245ac	1.36±0.2485ae
ANP/L-Arg组	3.19±0.3826	3.20±0.3859

^aP<0.05 vs假手术组,

^cP<0.05 vs ANP/L-Arg 12 h组,

^eP<0.05 vs ANP/L-Arg 24 h组.

结果表明, 胰腺炎大鼠存在肠黏膜组织NO含量减少, 应用SMT后肠黏膜组织NO含量降低更加明显, L-Arg可以显著提高肠黏膜组织中NO的含量.

2.4 肠黏膜通透性的检测值(表3)

表3 各组大鼠肠黏膜通透性的改变.

组别	12 h	24 h
假手术组		0.0693±0.0153
ANP/NS组	0.2892±0.1022ac	0.6615±0.1359ae
ANP/SMT组	0.4095±0.1009ac	0.5950±0.0736ae
ANP/L-Arg组	0.1832±0.0174	0.3379±0.03738

^aP<0.05 vs假手术组,

^cP<0.05 vs ANP/L-Arg 12 h组,

^eP<0.05 vs ANP/L-Arg 24 h组.

结果表明, 胰腺炎大鼠存在肠黏膜通透性升高, 应用SMT后肠黏膜通透性升高更加明显, L-Arg可以显著降低肠黏膜通透性.

2.5 细菌培养结果(表4)

表4 细菌培养结果(培养阳性数/培养标本数).

MLN 组别	n	胰腺		MLN		腹水		血需氧
		需氧	厌氧	需氧	厌氧	需氧	厌氧
假手术组	12	1	0	0	0	0	0	0
ANP/NS 12 h	12	6ac	3	4ac	0	3	1	1
ANP/SMT12 h	12	7ac	4ac	5ac	1	3	2	2
ANP/L-Arg12 h	12	1	0	1	0	1	0	0
ANP/NS 24 h	12	10ae	4ae	8ae	2	7ae	3	3
ANP/SMT24 h	12	11ae	6ae	9ae	3	9ae	3	2
ANP/L-Arg24 h	12	3	1	2	0	2	1	1

^aP<0.05 vs假手术组,

^cP<0.05 vs ANP/L-Arg 12 h组,

^eP<0.05 vs ANP/L-Arg 24 h组.

结果显示, 胰腺炎大鼠病程中出现脏器细菌移位, 应用SMT后细菌移位更加明显, 随时间延长而加重, 并以胰腺和MLN细菌移位为主, 后期腹水细菌移位有显著增加, L-Arg可以显著降低脏器细菌移位率.

3 讨论

ANP时, 机体处于严重的应激状态, 肠黏膜的低灌流状态使他产生缺血缺氧改变, 他所引起的缺血再灌注损伤是导致肠黏膜屏障功能障碍的主要原因之一[3]. 胰腺炎症程度愈重, 肠黏膜毛细血管的灌注量下降愈明显[4]. 本实验病理学检查显示ANP时存在肠黏膜机械屏障的损伤. 微循环的一些特定血管起到组织-血液屏障的作用, 急性炎症时, 这些血管通透性增加、屏障功能下降, 引起组织水肿. Kurose et al[5] 研究大鼠肠系膜微循环, 发现NO供体可显著减轻缺血-再灌注诱发的毛细血管后静脉的白细胞附壁、游出和白蛋白渗漏, 认为维持微血管的完整性、减轻白细胞-血管内皮细胞的相互作用是NO对缺血再灌注损伤的保护机制之一. NO也能防止内毒素血症引起的肠血管通透性增加[6].

我们观察到, ANP/NS 组12 h和ANP/NS 24 h大鼠肠黏膜组织NO含量呈下降趋势. 而ANP/SMT 12 h组和24 h组与相应时间点ANP/NS组比较, 其肠黏膜组织中的NO含量有所降低, 病理损害加重; ANP/L-Arg 12 h组和24 h组大鼠肠黏膜病理改变减轻, 与相应两个时间点ANP/NS组比较, 其肠黏膜组织中的NO含量有显著提高. 我们还观察到, ANP大鼠发病后12 h即有肠黏膜通透性增加, 而且随着病程延长而加重, 应用SMT后肠黏膜通透性增加更严重, 而应用L-Arg后肠黏膜通透性降低显著. 同时ANP大鼠发病12 h时即有细菌移位, 随着时间的延长细菌移位增加, 应用SMT后, 脏器细菌移位率显著增加, 而应用L-Arg治疗后脏器细菌移位率显著降低.

我们的试验显示, ANP大鼠肠黏膜组织中的NO含量随ANP的病程延长而合成减少, 应用SMT后可更加减少NO的含量, 加重肠黏膜的损伤, 增加肠黏膜通透性; 而应用L-Arg后, 肠黏膜组织NO含量增加, 肠黏膜损伤显著减轻, 肠黏膜通透性显著降低. 这说明内源性NO具有维持肠黏膜微血管完整性的作用, 这可能是NO改善ANP大鼠肠黏膜通透性的机制之一.

备注

编辑:张海宁

参考文献

1.	Aho HJ, Koskensalo SM, Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroenterol. 1980;15:411-416.  [PubMed]  [DOI]

2.	Resnick RH, Royal H, Marshall W, Barron R, Werth T. Intestinal permeability in gastrointestinal disorders. Use of oral [99mTc]DTPA. Dig Dis Sci. 1990;35:205-211.  [PubMed]  [DOI]

3.	Ammori BJ, Leeder PC, King RF, Barclay GR, Martin IG, Larvin M, McMahon MJ. Early increase in intestinal permeability in patients with severe acute pancreatitis: correlation with endotoxemia, organ failure, and mortality. J Gastrointest Surg. 1999;3:252-262.  [PubMed]  [DOI]

4.	Hotz HG, Foitzik T, Rohweder J, Schulzke JD, Fromm M, Runkel NS, Buhr HJ. Intestinal microcirculation and gut permeability in acute pancreatitis: early changes and therapeutic implications. J Gastrointest Surg. 1998;2:518-525.  [PubMed]  [DOI]

5.	Kurose I, Wolf R, Grisham MB, Granger DN. Modulation of ischemia/reperfusion-induced microvascular dysfunction by nitric oxide. Circ Res. 1994;74:376-382.  [PubMed]  [DOI]

6.	Dobosz M, Hać S, Wajda Z. Does nitric oxide protect from microcirculatory disturbances in experimental acute pancreatitis in rats? Int J Microcirc Clin Exp. 1996;16:221-226.  [PubMed]  [DOI]