CTGF靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

摘要

目的: 利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子 (CTGF) 短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA) 表达的质粒.

方法: 分别设计3对有小发夹结构的两条DNA序列, 经退火成互补双链, 再克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP中, 构建重组体, 转化DH5α菌株, 提取质粒行酶切鉴定后, 进行测序分析.

结果: CTGF的sRNA片段被成功克隆到pEGFP质粒载体中, 3个重组质粒shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 经酶切与测序证实构建成功.

结论: 成功构建了能表达CTGF shRNA的重组体, 为下一步探索肝纤维化基因治疗的新途径打好基础.

关键词: 结缔组织生长因子; RNA干扰; 短发夹RNA; 质粒

Construction and sequence analysis of connective tissue growth factor targeted recombinant plasmids by RNA interference

Yu-Hua Zhu, Chun-Qing Zhang, You-An Zhao, Yan-Liu Chu, Cheng-Gang Sun

Yu-Hua Zhu, Chun-Qing Zhang, Cheng-Gang Sun, Department of Gastroenterology, Shandong Provincial Hospital of Shandong University, Ji'nan 250021, Shandong Province, China

You-An Zhao, Yan-Liu Chu, Department of Gastroenterology, Shandong Qilu Hospital of Shandong University, Ji'nan 250021, Shandong Province, China

Supported by: the Fund for Young Scholars from Shandong Provincial Health Department, No. 2005-25.

Correspondence to: Chun-Qing Zhang, Department of Gastro-enterology, Shandong Provincial Hospital of Shandong University, Ji'nan 250021, Shandong Province, China. zyh6698@yahoo.com.cn

Received: October 13, 2005
Revised: October 25, 2005
Accepted: November 15, 2005
Published online: December 28, 2005

Abstract

AIM: To construct the recombinant plasmids expressing connective tissue growth factor (CTGF) short hairpin RNA (shRNA) by pEGFP plasmid vector.

METHODS: Three pairs of two DNA sequences containing small hairpin structure were designed and synthesized respectively, and then were formed into complementary chains by annealing. The obtained products were inserted into plasmid vector pEGFP containing U6 promoter. Then the recombinant plasmids were transformed into DH5α strain. Finally the plasmids that identified by restriction enzyme were used for sequence analysis.

RESULTS: The CTGF shRNA expression frames were successfully inserted into the plasmid vector pEGFP, and the shRNA coding sequences of the 3 obtained recombinant plasmids were consistent with the designed fragments. The cloned recombinants were identified and confirmed by endonuclease digestion and sequence analysis.

CONCLUSION: The recombinant plasmids of shRNA for CTGF are successfully constructed.

Key Words: Connective tissue growth factor; RNA interference; Short hairpin RNA; Plasmid

0 引言

RNA干扰 (RNAi)是新近发展起来的一种较基因敲除更快速、简洁、经济的新技术, 其机理是通过导入双链RNA (dsRNA), 引起生物体或细胞内同源mRNA降解. 导入的dsRNA在细胞内被一种称为Dicer的核酶裂解成长约21-25个核苷酸 (nt) 的小分子干扰RNA (siRNA), siRNA随后与胞质蛋白质成分结合成RNA诱导沉默复合物 (RNA induced silencing complex, RISC), 随siRNA解旋, RISC激活, 活化的RISC通过碱基配对与同源mRNA结合, 并使其降解, 这种序列特异性mRNA降解导致同源基因沉默. 可同时阻断多个基因表达, 不仅可用于研究基因功能, 而且可高效、靶向性阻断目的基因表达, 达到治疗目的[1-4]. RNAi抑制靶基因表达效率可达90%以上, 因此, RNAi将有望为抗肝纤维化治疗带来新希望[5].

结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF) 是一种新发现的促成纤维细胞分裂和胶原沉积的生长因子, 被认为与转化生长因子β1有密切联系, 在许多组织器官纤维化时表达明显增高, 其在肝纤维化的作用逐渐受到关注[6-8].

我们拟用小鼠U6启动子和RNA polymeraseⅢ (PolⅢ) 终止信号, 构建针对CTGF的特异性shRNA真核表达载体. 拟用此载体质粒转染培养的肝星状细胞, 观察该质粒对其CTGF表达的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 材料

质粒pEGFP (含绿色荧光蛋白EGFP、耐卡那霉素、抗新霉素Rneo基因及人U6启动子) 购自武汉晶赛生物公司; 感受态菌株DH5α山东省立医院中心实验室保存. 质粒抽提试剂盒购自中鼎公司; 所用酶类; T4 DNA Ligase、T4 Polynucleotide Kinase、SalI、PstI、BamHI、HindIII购自NEB公司.

1.2 方法

1.2.1 靶向CTGF的siRNA及发夹式siRNA的设计: 根据Genbank中报道的大鼠CTGF的核苷酸序列 (NM_022266), 参考siRNA的设计策略, 分别设计三对siRNA序列, 使用BLAST将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较, 排除和其他编码序列/EST同源的序列. PEGFP质粒中在U6启动子后连接针对CTGF基因的干扰片段, 反义片段以后接TTTTTT, 以终止转录. 为了便于克隆与鉴定, shRNA5'端和3'端分别带有两个BamHⅠ和HindⅢ酶切位点, 终止信号后带有SalⅠ的酶切位点, 形成BamHⅠ和HindⅢ酶切位点, 终止信号后带有SalⅠ的酶切位点形成BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalⅠ+HindⅢ的结构 (引物结构; BamHⅠ +Sense+Loop+Antisense+终止信号+ SalⅠ+ HindⅢ), 由上海生工公司合成. 引物序列如下:

序列 1: 靶序列 1 AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC CTGF1-1 (正义链)

5'-GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGAAGAGACCCTTTTTTGTCGACA -3'CTGF1-2 (反义链) 3'-GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTCTGGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5'序列 2: 靶序列 2 AAGACCTACCGGGCTAAGTTC CTGF2-1(正义链)5'-GATCCGACCTACCGGGCTAAGTTCTTCAAGACGGAACTTAGCCCGGTAGGTCTTTTTTGTCGACA -3'CTGF2-2 (反义链) 3'-GCTGGATGGCCCGATTCAAGAAGTTCTGCCTTGAATCGGGCCATCCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5'序列 3: 靶序列 3 CGATGGCGAGATCATGAAA CTGF3-1 (正义链)5'-GATCCGCGATGGCGAGATCATGAAATTCAAGACGTTTCATGATCTCGCCATCGTTTTTTGTCGACA -3'CTGF3-2 ((反义链)3'-GCGCTACCGCTCTAGTACTTTAAGTTCTGCAAAGTACTAGAGCGGTAGCAAAAAACAGCTGTTCGA-5'.

1.2.2 siRNA真核表达载体构建方法: 退火连接、磷酸化; 用50 µL annealing buffer溶解上述2OD单链目的基因片段. 各取2 µL (即2 µL CTGF1-1+2 µL CTGF1-2)+16 µL annealing buffer 94℃退火自然冷却至室温. 再将双链退火片段进行磷酸化. 酶切: 将质粒PEGFP用BamHⅠ和HindⅢ双酶切, 10 g/L琼脂糖凝胶回收大片段(图1). 连接; 将磷酸化退火片段约0.3 pmol与线性化PEGFP质粒载体约0.03 pmol进行连接, 22℃水浴反应过夜. 转化; 各取5 µL连接产物转化感受态细胞DH5α, 涂布于含Kanar抗性 (终浓度为20 mg/L) 的LB平板上, 37℃恒温箱培养过夜. 筛选; 从每个培养皿上各挑取4个单克隆菌落接种于3 mL含Kanar抗性 (终浓度为20 mg/L) 的LB培养液中, 37℃恒温摇床培养过夜. 提取质粒, 酶切鉴定; 用试剂盒小量提取质粒后, 分别用PstⅠ和SalⅠ做酶切鉴定, 酶切产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳. 重组质粒进行测序鉴定, 将鉴定证实后的细菌培养扩增, 每0.8 mL过夜培养细菌 (摇至对数晚期) 加无菌甘油0.2 mL, 混匀后放入-70℃冰箱冻存. 取1管冻存菌液送武汉晶赛公司测定.

图1 质粒pEGFP酶切电泳图谱.

2 结果

2.1 酶切鉴定的结果

质粒pEGFP是有PstⅠ的酶切位点, 应该能够被PstⅠ所酶切, 而插入目的基因片段之后, PstⅠ酶切位点被取带, 故不能被PstⅠ所酶切. 其pEGFP的MCS如下; -HindⅢ-XbaⅠ-SalⅠ-PstⅠ-BamHⅠ-U6 Promotor-EcoRⅠ-SalⅠ-XbaⅠ-DraⅢ (图2); 在插入的目的基因片段里, 我们设计了一个SalⅠ的酶切位点, 插入在质粒PEGFP的BamHⅠ和HindⅢ之间, 如若插入正确, 就能被SalⅠ酶切出一条约400 bp的DNA小带; 经酶切鉴定分析, 质粒CTGF1-1、CTGF2-5、CTGF3-9均符合设计要求, 说明重组质粒即为克隆正确的质粒(图3).

图2 pEGFP质粒载体图谱. MCS: 5'-MIuⅠ-SmaⅠ-HindⅢ-SphⅠ-PstⅠ-SalⅠ-XbaⅠ-BamHⅠ-U6promoter-EcoRⅠ-SalⅠ-XbaⅠ-DraⅢ-3'

图3 10g/L Agase 凝胶电泳, 电泳图谱.

2.2 重组质粒测序分析结果

经酶切后, 挑取鉴定正确的克隆测序, 结果显示3个重组质粒shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 表明载体构建正确.

3 讨论

目前在研究哺乳动物细胞的基因功能方面, 产生RNAi效应主要应用的方法分为两类: 一类为体外转录或化学合成siRNA经脂质体或逆转录病毒载体等转染细胞后介导RNAi; 另一类为发夹式siRNA表达载体转染细胞后表达的发夹式siRNAs诱导RNAi. 化学合成的siRNAs抑制作用时间短, 合成成本昂贵, 并且易于污染RNA酶而降解, 因此限制其应用. 而发夹式siRNAs表达载体转染细胞后表达发夹式siRNAs成本较低, 它可以在细胞内RNA酶的作用下被切割成与体外合成的siRNA相同的序列与结构, 诱导RNAi. 同时, 它可以稳定持续地表达发夹式siRNA, 使RNAi作用时间更长、更稳定[9,10].

EGFP基因是在GFP的基础上经碱基修饰和人源化改造而来的, 不仅无种属特异性, 而且发光强度和细胞毒作用均获改善, 从而广泛作为报告基因用于多种基因转移系统[11]. 使用荧光显微镜, EGFP很容易被观察并判断定位; 利用流式细胞仪, 可以测定细胞表达EGFP的阳性细胞率和平均荧光强度.

美国学者Bradham et al[12]于1991年首次发现了人类结缔组织生长因子 (CTGF), 随后有大量的研究表明它是一个重要的促组织纤维化蛋白. 研究表明, 在CTGF启动子序列128-162位置上存在着一个重要的TGF-β1调控元件, 认为CTGF是TGF-β1致纤维化作用的直接下游效应介质[13]. 还有研究表明, 在许多纤维化疾病中CTGF与TGF-β1的表达同步增高, TGF-β1主要在组织纤维化病变的早期表达, 而CTGF 持续表达被认为是纤维化病变缓慢进展的重要因素, CTGF表达增加可能是器官纤维化发生发展的中心环节[6,7].

在慢性肝病患者及实验性肝纤维化动物肝组织中CTGF表达水平增高, 并与肝纤维化积分成正相关[14]. CTGF可促进包括肝星状细胞(HSC)在内的多种纤维活性细胞合成及分泌细胞外基质(ECM)[15,16]. 因此如能阻抑CTGF表达, 将有望减少ECM合成及分泌, 从而阻止肝纤维化发生及发展.

我们构建的CTGFShRNA真核表达载体使用了U6启动子指导siRNA编码序列的转录、PolⅢ识别的终止信号终止转录, 符合siRNA表达载体的要求. 经过酶切和测序分析无碱基突变, 证实构建成功. 通过GeneBank数据库BLAST分析, 我们选用的shRNA编码序列没有明显同源的靶位点, 这为RNAi的特异性提供了保障. 另外, 此载体上EGFP基因为转染效率的测定提供了便利.

目前研究证实, RNA干扰的机制是一复杂的过程, 而不同细胞系中U6启动子转录后RNA受到抑制和干扰的效果有较大差异, 以致在有些细胞系中不能产生很好的干扰效果. 不同位置设计的siRNA片段, 作用有显著差异. 这也是一般设计时应设计3-4个不同的RNA片段, 在其中筛选效率最高的片段的干扰策略[17]. 我们针对CTGF目的基因分别设计了3条shRNA, 可通过转染肝星状细胞, 检测其对CTGFmRNA的抑制效率以筛选有效的抑制序列, 为进一步研究CTGF在肝纤维化中的作用以及探索肝纤维化的基因治疗奠定基础.

备注

电编: 张勇 编辑: 菅鑫妍 审读: 张海宁

参考文献

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