灭活的双歧杆菌治疗菌群失调致小鼠肠源性感染

摘要

目的: 观察灭活的双歧杆菌对菌群失调致小鼠肠源性感染的治疗作用.

方法: 40只昆明种小鼠随机分为4个处理组: 活菌组、死菌组、自然恢复组、正常对照组, 每组10只. 对血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、血清球蛋白(GLO)、γ-谷氨酰氨转肽酶(GGT)、血清尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)、血肌酐(CRE)以及组织匀浆内的示踪菌进行测定.

结果: 死菌组与自然恢复组比较, TP、GLO明显升高(71.46±2.01 g/L vs 64.61±2.16 g/L; 35.63±1.57 g/L vs 330.73±1.03 g/L, P<0.05), GGT、BUN则显著降低(2.47±0.28 IU/L vs 7.13±1.19 IU/L; 8.32±0.71 mmol/L vs 12.05±0.64 mmol/L, P<0.01). 死菌组与活菌组、正常对照组比较, LDH明显降低(2 561.23±61.40 IU/L vs 2 951.70±155.61 IU/L, 2 895.27±104.38 IU/L, P<0.05). 死菌组与自然恢复组比较, 肾、肝、肺组织匀浆内肠杆菌数量均明显下降(1.19±0.37, 1.56±0.20, 1.62±0.15 vs 2.17±0.97, 2.42±0.14, 2.20±0.09, P<0.05或P<0.01).

结论: 双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌悬液相同的抗菌群失调致小鼠肠源性感染作用.

关键词: 双歧杆菌; 菌群失调; 肠源性感染; 血清学; 示踪菌

Application of heat-killed bifidobactera in treatment of enterogenic infection caused by dysbacteriosis in mice

Yong-Zhi Lun, Jie Hu, Zhong-Peng Li, Yong-Qing Zhang, Ben-Zheng Zhou, Ya-Li Liu

Yong-Zhi Lun, Ya-Li Liu, Medical College of Dalian University; Key Laboratory of Bio-organic Chemistry of Liaoning Province, Dalian 116622, Liaoning Province, China

Jie Hu, Zhong-Peng Li, Yong-Qing Zhang, Ben-Zheng Zhou, Medical College of Dalian University, Dalian 116622, Liaoning Province, China

Supported by: College and University Research Project of Education Ministry of Liaoning Province, No. 2023901020.

Correspondence to: Yong-Zhi Lun, Department of Pathogenic Biology, Medical College of Dalian University, Dalian 116622, Liaoning Province, China. lunyz@163.com

Received: September 29, 2005
Revised: October 1, 2005
Accepted: October 19, 2005
Published online: December 28, 2005

Abstract

AIM: To observe the curative effect of heat-killed bifi-dobactera on dysbacteriosis-induced enterogenic infe-ction in mice.

METHODS: A total of 40 mice were randomly divided into living bacterium group, heat-killed bacterium group, spontaneous recovery group, and normal control group (10 for each). After treatment with the corresponding methods, the serum indexes such as total protein (TP),

albumin (ALB), globulin (GLO), γ-Glutamyl transpepti-dase (GTT), blood urea nitrogen (BUN), lactic dehydro-genase (LDH), creatinine (CER), and tagged bacterium in the homogenate of the mice were detected.

RESULTS: The levels of TP and GLO in the heat-killed bacterium group were significantly increased (71.46±2.01 g/L vs 64.61±2.16 g/L; 35.63±1.57 g/L vs 330.73±1.03 g/L, P < 0.05), while the levels of GGT and BUN were significantly decreased (2.47±0.28 IU/L vs 7.13±1.19 IU/L; 8.32±0.71 mmol/L vs 12.05±0.64 mmol/L, P < 0.01) as compared with those in the spontaneous recovery group. The level of LDH in the heat-killed bac-terium group was significantly decreased as compared with that in the living bacterium group and the normal control group (2 561.23±61.40 vs 2 951.70±155.61, 2 895.27±104.38, P < 0.05). The numbers of the entero-bactera was markedly deceased in the renal, hepatic and pulmonary tissues of the heat-killed bacterium group in comparison with those in the spontaneous recovery group(1.19±0.37, 1.56±0.20, 1.62±0.15 vs 2.17±0.97, 2.42±0.14, 2.20±0.09, P < 0.05 or P < 0.01).

CONCLUSION: The heat-killed bifidobactera are effec-tive in the treatment of enterogenic infection caused by dysbacteriosis in mice, and the effect is the same as that of the living bifidobactera.

Key Words: Bifidobacterium; Dysbacteriosis; Enterogenic infection; Serology; Tagged bacterium

0 引言

肠源性感染即肠道中致病菌或条件致病菌通过肠黏膜侵入血循环和/或其他脏器引发的感染. 目前肠源性感染已成为医院内感染的主要来源, 其病死率超过30%, 其中以抗生素滥用造成菌群失调而引起的肠源性感染尤为突出[1]. 正常情况下, 包括双歧杆菌、乳杆菌在内的正常菌群黏附于肠黏膜, 形成空间位阻, 抵抗外来菌的入侵[2,3]. 目前已有双歧杆菌制剂研制成功并投放市场, 成为防治肠源性感染的首选药物. 但国内外开发的制剂均是活菌, 其有效期不过一年, 这使其应用范围与条件受到很大的限制. 已有研究表明灭活的双歧杆菌制剂可能具有与活菌相同的防治肠源性感染的功效[4,5]. 我们通过检测实验小鼠的临床血清学指标以及组织匀浆内示踪菌, 初步研究了灭活的双歧杆菌对菌群失调致小鼠肠源性感染的治疗作用, 为进一步研制双歧杆菌灭活制剂打下扎实基础.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株: 双歧杆菌DM8504菌株引自大连医科大学微生态学研究所, 经中国科学院微生物研究所鉴定, 该菌株属于青春型双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis).

1.1.2 双歧杆菌菌悬液的制备[4]: 将双歧杆菌接种至BS肉汤培养基中, 37℃厌氧培养48 h, 菌悬液4 000 r/min离心10 min, 分离得到耗尽培养上清. 用生理盐水(normal sodium, NS)重悬细菌, 所得菌悬液分为活菌组和死菌组. 其中死菌组水浴灭活处理(经BS肉汤检菌, 证明灭活菌存在, 并且仍保持正常细菌形态). 将活、死两组菌悬液用NS洗3次离心后, 弃上清, 耗尽培养上清重悬活、死双歧杆菌沉淀, 使菌悬液浓度均达到1×10¹¹ CFU/L.

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与造模: 健康昆明种小鼠(大连大学实验动物中心提供)40只, 雌雄各半, 鼠龄6-8 wk, 体质量为20±2 g. 用9 g/L的NS配制成浓度为200 g/L的青霉素(大连美罗药业股份有限公司生产, 100万单位青霉素钠/1.0 g/瓶)溶液. 将40只昆明种小鼠随机分为活菌组、死菌组、自然恢复组、正常对照组4组, 每组10只. 除正常对照组外, 其余3组小鼠进行青霉素液腹腔注射, 0.2 mL/(只·d), 其抗生素用量达到2 000 mg/(kg·d), 连续3 d, 造成抗生素菌群失调动物模型[6]. 从第4天开始, 活菌组采用双歧杆菌活菌悬液灌胃; 死菌组采用双歧杆菌灭活菌悬液灌胃; 自然恢复组小鼠采用NS灌胃, 均为0.4 mL/(只·d), 连续3 d.

1.2.2 临床血清学指标检测: 4组小鼠分别摘眼球采血处死, 利用日本Olympus-AU400全自动生化仪对血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、血清球蛋白(GLO)、γ-谷氨酰氨转肽酶(GGT)、血清尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)和血肌酐(CRE)进行测定.

1.2.3 组织匀浆内示踪菌检测: 小鼠处死后迅速置于750 mL/L乙醇中浸泡5 min. 每只小鼠均无菌操作取肾、肝、肺等脏器, 并与血管及结缔组织剥离. 将脏器放入盛有1 mL 4℃预冷NS的无菌平皿中, 用注射器内芯挤压研磨脏器, 一次性尼龙滤网过滤分离, 收集组织匀浆, 取200 μL涂于EMB平板(肠杆菌选择培养基), 37℃孵育培养24 h, 菌落计数.

统计学处理 所有数据经SPSS12.0统计软件进行两独立样本的t检验分析.

2 结果

实验组小鼠经双歧杆菌活菌悬液、灭活菌悬液以及NS灌胃治疗后, 检测包括正常对照组小鼠在内的临床血清学指标及组织匀浆内示踪菌分布(表1, 表2). 其中活菌组、死菌组各死亡1只小鼠, 自然恢复组死亡2只小鼠.

表1 实验组及正常对照组临床血清学检测结果 (mean±SE).

指标		死菌组	自然恢复组	正常对照组
TP(g/L)	83.34±5.31	71.46±2.01	64.61±2.16a	79.84±4.75
ALB(g/L)	40.28±2.43	35.83±0.93	32.74±1.19	39.82±0.89
GLO(g/L)	43.07±3.26	35.63±1.57	30.73±1.03a	44.96±2.94
GGT(IU/L)	2.08±0.25	2.47±0.28	7.13±1.19b	2.15±0.17
BUN(mmol/L)	9.07±1.10	8.32±0.71	12.05±0.64b	8.65±0.64
LDH(IU/L)	2951.70±155.61a	2561.23±61.40	2469.84±99.52	2895.27±104.38a
CRE(μmol/L)	39.05±3.06	42.99±4.70	44.55±3.86	40.98±4.10

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 死菌组.

表2 实验组及正常对照组组织匀浆内肠杆菌检测结果 (mean±SE, Lg10ⁿ/).

标本	活菌组
肾	1.23±0.30	1.19±0.37	2.17±0.97a	0.92±0.11
肝	1.39±0.19	1.56±0.20	2.42±0.14a	1.50±0.12
肺	1.48±0.25	1.62±0.15	2.20±0.09b	1.44±0.17

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 死菌组.

2.1 TP、GLO、GGT、BUN水平

死菌组与活菌组、正常对照组比较, TP、GLO、GGT、BUN与无明显差异; 死菌组与自然恢复组比较, TP、GLO明显升高(P<0.05), GGT、BUN则显著降低(P<0.01).

2.2 ALB、CRE水平

死菌组与活菌组、正常对照组、自然恢复组比较, ALB、CRE均无明显差异, 但双歧杆菌菌悬液治疗效果较明显, 其中活菌组小鼠血清中ALB、CRE水平比死菌组小鼠更加接近正常值.

2.3 LDH水平

死菌组与活菌组、正常对照组比较, LDH明显降低(P<0.05); 死菌组与自然恢复组比较, LDH无明显差异, 但死菌组小鼠血清中LDH水平比自然恢复组小鼠接近正常值.

2.4 组织匀浆内肠杆菌数量

死菌组与活菌组、正常对照组比较, 肾、肝、肺等脏器组织匀浆内肠杆菌数量无明显差异; 死菌组与自然恢复组比较, 肾、肝、肺等组织匀浆内肠杆菌数量均明显下降.

3 讨论

现已明确以双歧杆菌为主的专性厌氧菌定植于肠黏膜上皮, 能阻止条件致病菌(多为G-杆菌与球菌)对肠黏膜的黏附和定植, 具备所谓的定植抗力, 是防止细菌或(和)内毒素移位进而发生肠源性感染的重要因素. 临床上由于大量使用抗生素引起肠道内条件致病菌过度繁殖, 必然导致菌群失调, 损害肠道益生菌的定植抗力, 是致病菌横向经肠黏膜逸出肠腔的重要诱因[7-10].

目前认为双歧杆菌通过代谢产生大量的乳酸和乙酸, 降低肠道的pH及Eh值, 改善局部微环境, 促进肠菌群失调的恢复[2]. 但活菌制剂存在保藏及运输不易等缺点, 而灭活的死菌制剂, 具有细菌浓度稳定, 不会随时间的延长而出现递减的可能; 不会经肠道转移造成二度感染; 没有抗药基因转移, 不会出现增加病原菌抗药性的危险; 不易受胃酸屏障的影响; 可与抗生素合用等诸多优点[11,12].

研究表明双歧杆菌无论是否灭活, 均可黏附于肠黏膜上皮细胞, 而且双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌相似的生态效应, 因此对肠道生理菌群具有一定的调节作用, 并进而通过与其他厌氧菌一起占据肠黏膜表面, 形成生物学屏障, 阻止病原菌及条件致病菌的定植和入侵[13-15], 从而阻止肠源性感染的发生.

由于肠源性感染与血液和(或)脏器感染直接相关, 因此可以通过检测某些临床血清学指标的变化来监控其发生与发展, 甚至预后. 其中TP、ALB、GLO水平的降低主要见于肝肾疾病、烧伤、慢性消化道疾病、严重腹泻等, BUN与GGT水平的增高分别与急慢性肾病和肝病相关, LDH水平直接反映机体心肾功能, CRE水平的增高则表明发生严重肾实质性损害.

从临床血清学检测结果可知, 与正常对照组及自然恢复组相比, 通过对肠源性感染小鼠进行双歧杆菌死活菌悬液灌胃治疗, 所有检测指标均有明显改善, 除LDH水平外, 其他指标均恢复至正常水平. 此外, 通过双歧杆菌死活菌悬液两者之间的相互比较, 可以发现活菌组小鼠临床血清学指标恢复状况优于死菌组小鼠, 即活菌悬液的短期治疗效果仍然优于灭活菌悬液, 但除LDH水平外两者之间无显著性差异. 而组织匀浆内肠杆菌检测结果表明, 双歧杆菌死活菌悬液灌胃治疗效果相同且均明显, 尤其是小鼠肺感染的治疗效果更为显著. 动物实验证实了双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌悬液相同的抗菌群失调致小鼠肠源性感染作用, 进而表明双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌相似的生理效应, 一方面恢复肠道生理菌群的生态平衡, 保护并修复肠道黏膜, 另一方面促进肠道益生菌增殖, 从而在防治肠源性感染中起到了良好的治疗效果, 并在一定程度上替代抗生素.

备注

电编: 张敏 编辑: 菅鑫妍 审读: 张海宁

参考文献

1.	Peng YZ, Yuan ZQ, Xiao GX. Effects of early enteral feeding on the prevention of enterogenic infection in severely burned patients. Burns. 2001;27:145-149.  [PubMed]  [DOI]

2.	Servin AL. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobac-teria against microbial pathogens. FEMS Microbiol Rev. 2004;28:405-440.  [PubMed]  [DOI]

3.	康 白.  双歧杆菌. 大连: 大连海事大学出版社 1998; 1-2, 78.  [PubMed]  [DOI]

4.	伦 永志, 黄 敏, 袁 杰利, 康 白. 灭活的双歧杆菌对肠上皮细胞黏附及其影响因素的研究. 中国微生态学杂志. 2000;12:314-316.  [PubMed]  [DOI]

5.	Alvarez-Olmos MI, Oberhelman RA. Probiotic agents and infe-ctious diseases: a modern perspective on a traditional therapy. Clin Infect Dis. 2001;32:1567-1576.  [PubMed]  [DOI]

6.	伦 永志, 黄 敏, 袁 杰利, 康 白. 灭活双歧杆菌调整小鼠抗生素相关性菌群失调. 中国微生态学杂志. 2002;14:8-9.  [PubMed]  [DOI]

7.	O'Boyle CJ, MacFie J, Mitchell CJ, Johnstone D, Sagar PM, Sedman PC. Microbiology of bacterial translocation in humans. Gut. 1998;42:29-35.  [PubMed]  [DOI]

8.	伦 永志, 黄 敏, 袁 杰利, 康 白. 灭活的双歧杆菌对EPEC的黏附抑制作用. 中国微生态学杂志. 2003;15:13-14.  [PubMed]  [DOI]

9.	Servin AL, Coconnier MH. Adhesion of probiotic strains to the intestinal mucosa and interaction with pathogens. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2003;17:741-754.  [PubMed]  [DOI]

10.	Perez PF, Minnaard Y, Disalvo EA, De Antoni GL. Surface pro-perties of bifidobacterial strains of human origin. Appl Environ Microbiol. 1998;64:21-26.  [PubMed]  [DOI]

11.	Fourniat J, Colomban C, Linxe C, Karam D. Heat-killed Lactob-acillus acidophilus inhibits adhesion of Escherichia coli B41 to HeLa cells. Ann Rech Vet. 1992;23:361-370.  [PubMed]  [DOI]

12.	Coconnier MH, Bernet MF, Chauviere G, Servin AL. Adhering heat-killed human Lactobacillus acidophilus, strain LB, inhibits the process of pathogenicity of diarrhoeagenic bacteria in cultured human intestinal cells. J Diarrhoeal Dis Res. 1993;11:235-242.  [PubMed]  [DOI]

13.

Fujiwara S, Hashiba H, Hirota T, Forstner JF. Inhibition of the binding of enterotoxigenic Escherichia coli Pb176 to human intestinal epithelial cell line HCT-8 by an extracellular protein fraction containing BIF of Bifidobacterium longum SBT2928: suggestive evidence of blocking of the binding receptor gangli-otetraosylceramide on the cell surface. Int J Food Microbiol. 2001;67:97-106.  [PubMed]  [DOI]

14.

Zhong SS, Zhang ZS, Wang JD, Lai ZS, Wang QY, Pan LJ, Ren YX. Competitive inhibition of adherence of enterotoxigenic Escherichia coli, enteropathogenic Escherichia coli and Clos-tridium difficile to intestinal epithelial cell line Lovo by purified adhesin of Bifidobacterium adolescentis 1027. World J Gastroenterol. 2004;10:1630-1633.  [PubMed]  [DOI]

15.	Gopal PK, Prasad J, Smart J, Gill HS. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxi-genic Escherichia coli. Int J Food Microbiol. 2001;67:207-216.  [PubMed]  [DOI]