端粒酶逆转录酶肽-核酸病毒样颗粒疫苗的制备及免疫原性鉴定

摘要

目的: 设计人端粒酶逆转录酶(hTERT)的新型病毒样颗粒疫苗, 并鉴定其表达蛋白的免疫原性和疫苗转染效率 .

方法: 合成阳离子抗原肽K₁₈P₉, 同时将人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和hTERT的克隆入真核双表达载体pTCAE中, 再将多肽和核酸疫苗结合于同一疫苗颗粒, 并将其转染入真核细胞内, ELISA法和免疫印迹法检测hGM-CSF和hTERT的免疫原性, 同时评价疫苗的转染效率 .

结果: 酶切及测序结果证实已成功构建含hGM-CSF和hTERT的载体pTGH, 电镜等结果证实核酸被包装肽包裹形成病毒样颗粒, ELISA法和免疫印迹法证实疫苗在体外对真核细胞的转染效应以及hGM-CSF和hTERT的免疫原性, 与阳性对照DOTAP组比较, 疫苗转染效率约可达78.5% .

结论: 成功构建了具有免疫原性的hTERT肽-核酸病毒样颗粒疫苗 .

关键词: 端粒酶逆转录酶; 病毒样颗粒疫苗; 细胞毒T淋巴细胞.

Construction of virus-like particle peptide-nucleic acid vaccine of human telomerase reverse transcriptase and identification of its immunogenicity

Hong Guo, Jia Hao, Chao Wu, Dian-Chun Fang

Hong Guo, Dian-Chun Fang, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Jia Hao, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Chao Wu, Department of Clinical Microbiology, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30400208.

Correspondence to: Hong Guo, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China. haoguo11@yahoo.com

Received: August 29, 2005
Revised: September 10, 2005
Accepted: October 11, 2005
Published online: November 28, 2005

Abstract

AIM: To construct a novel virus-like particle peptide-nucleic acid vaccine (VPNV) of human telomerase reverse transcriptase (hTERT), and to identify its imm-unogenicity and transfection activity.

METHODS: Cationic antigenic peptide K₁₈P₉ was syn-thesized and purified, then human GM-CSF and TERT gene were cloned into eukaryotic expression vector pTCAE. The peptide was combined with the nucleic acid vaccine to make VPNV, which were transfected into eukaryotic cells COS-7. The immunogenicity of hGM-CSF and hTERT were detected by enzyme linked imm-unosorbent assay (ELISA) and Western blotting.

RESULTS: Restriction enzyme digestion and sequen-ce analysis confirmed that hGM-CSF and hTERT were cloned into pTCAE and the nucleic acid vaccine of hTERT gene was constructed successfully. Under ele-ctronic microscopy, nucleic acid was packaged by pep-tide, forming into virus-like particle. Furthermore, the transfection activity of VPNV and the immunogenic-ity of hGM-CSF and hTERT could reach 78.5% as co-mpared with the positive controls.

CONCLUSION: The VPNV is successfully constructed, and its immunogenicity is also identified.

Key Words: Human telomerase reverse transcriptase; Virus-like particle vaccine; Cytotoxic T-lymphocytes

0 引言

人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)为人端粒酶催化亚单位, 是癌细胞永生化的必要途径, 在消化道恶性肿瘤中大多过度表达[1-5], 且具有高度保守性[6-11], 因此如以hTERT为靶标制备消化道肿瘤疫苗, 将有望激发机体特异性抗肿瘤的免疫应答. 利用肿瘤疫苗有效激活特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL), 是实现肿瘤主动免疫治疗的关键所在[12-17]. 目前高效的新型CTL肿瘤疫苗仍处于积极的研究和探索中. 我们结合基因治疗领域富正电荷肽类DNA转运载体的进展, 将正电荷包装肽与带负电荷质粒DNA结合, 并同时采用hTERT全长抗原蛋白及其低亲和力表位异形肽p572Y[18-20], 以人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor, hGM-CSF)为免疫佐剂[21,22], 制备并鉴定了新型的病毒样颗粒肽-核酸疫苗(virus-like particulate peptide-nucleic acid vaccine, VPNV), 为进一步探索其抗肿瘤免疫作用奠定了基础 .

1 材料和方法

1.1 材料

以AB431A型多肽合成仪(Pelin Elmer公司)按照标准Fomc方案合成阳离子抗原肽(K)₁₈ YLFFYRKSV(其N端含18个赖氨酸, C端为P572Y, K₁₈P₉), 用ÄKTA explorer 100型中压液相色谱仪纯化, Delta 600型反向高压液相色谱仪鉴定纯度, 纯度>95％; API 2000LC/MS/MS型质谱仪测定相对分子质量为3528.8. 纯化产物冻干, -70℃冻存备用. 以pcDNA3.1-GM-CSF为模板扩增人GM-CSF cDNA, 并将其克隆入双表达真核载体pTCAE[23]的BglⅡ-EcoRⅠ表达盒中, 构建重组质粒pTG. 再将克隆有人端粒酶催化亚单位hTERT cDNA的质粒pGRN145(美国Geron公司惠赠)用EcoRⅠ酶切后克隆入载体pET28a中, 再行SalⅠ-BglⅡ消化, 并将含有hTERT的片段连接入pTG的SalⅠ-BamHⅠ(BglⅡ同尾酶)表达盒中, 形成hGM-CSF和hTERT双表达的重组质粒, 并命名为pTGH. 酶切鉴定pTGH并送公司测序. K_l8P₉多肽分子中每个赖氨酸(K)的氨基(NH₄⁺)携带一个正电荷, 故每个多肽K_l8P₉分子携带18个正电荷; 而DNA分子中每个脱氧核糖核酸的平均分子量为330 Da, 含1个磷酸根(PO₄^-), 携带一个负电荷. 因此, 制备本疫苗时二者正负电荷的比值r反映了质粒与肽的用量关系为: M_肽: M_DNA = r×3 528.8/18∶330/1, 即M_肽 = 0.594×r×M_DNA, 同时可通过DNA阻滞试验和DNaseⅠ保护试验获得最佳r值, 以确定制备疫苗时肽与质粒的最佳相对用量.

1.2 方法

参照文献[24]方案制备疫苗, 将不同量的阳离子抗原肽和2 μg质粒DNA分别溶于50 μL的150 mmol/L的NaC1水溶液中, 将肽溶液逐滴滴人混旋的DNA溶液中, 5 μL/min, 滴定完毕后产物继续混旋30 min, 室温静置60 min, 形成不同电荷比的多肽包裹的DNA聚合物. 制备r值分别为0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0的不同阳离子肽-DNA聚合物, 各取3 μL样品于8 g/L琼脂糖凝胶电泳加样后电泳, 观察不同疫苗产物的泳动情况. 取制备产物50 μL, 与DNase Ⅰ(Sigma)在1×工作液(10 mmol/L CaC1₂, 5 mmol/L MgC1₂), 37℃孵15 min. 加入2 μL 0.5 mol/L的EDTA灭活, 再加入等体积25 g/L胰酶溶液消化40 min, 释放未降解的质粒DNA, 经2次1∶1酚氯仿抽提、乙醇沉淀后溶于水中. 8 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 观察质粒留存情况. 6孔培养板内将COS-7细胞单层培养至覆盖面积30％. 更换培养液为2 mL无血清培养基, 加入100 μL制备好的疫苗, 同时用DOTAP法将5 μg质粒pTGH转入另组细胞, 孵育4 h, 更换完全培养基培养48 h, 收获细胞. 用ELISA检测hGM-CSF的表达水平, 由此分析疫苗体外转染效应的高低. 用常规Western方案, 以兔抗人hTERT抗体, 以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗, 经二氨基联苯胺(3, 3-diaminobenzidine, DAB)化学显色, 检测hTERT的表达. 将新鲜制备的疫苗15 μL滴于200目Í网的碳膜上, 室温5 min. 吸水纸吸干, 晾干30 s. 以20 g/L磷酸钨盐溶液负染30 s, 吸水纸吸干, 晾干30 s. 80 KV透射电镜观察.

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体的细胞转染: 用FuGENE6转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-DNAPTP1及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞, 48 h后收获细胞.

1.2.2 细胞mRNA提取: 用mRNA纯化试剂盒, 直接提取转染了重组表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性、定量分析.

1.2.3 消减杂交文库的建立: 采用PCR-Select cDNA Subtraction Kit, 常规SSH方法按说明书进行: 转染了重组表达质粒及空载体的HepG2细胞cDNA分别标记为Tester和Driver, 经Rsa Ⅰ消化, 产生相对较短的平端片段, 纯化酶切产物. 将Tester的cDNA分为两份, 分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2, 然后与过量的Driver cDNA进行杂交; 合并两种杂交产物后再与Driver cDNA做第2次杂交; 最后将杂交产物做选择性PCR扩增, 使Tester cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增.

1.2.4 消减文库扩增及克隆鉴定分析: 扩增产物与pGEM-Teasy载体连接, 转化DH5α感受态细菌, 在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37℃培养16-18 h. 挑取白色菌落, 增菌, 以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增, 产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 证明含有插入片段(200-1 000 bp)后, 测序(上海联合基因公司). 应用生物信息学将测得序列与GenBank数据库进行同源性分析.

2 结果

我们按照标准Fmoc方案合成阳离子双功能线性肽K₁₈P₉, 其中由18个多聚赖氨酸构成的K18可形成一个正电荷富集的DNA结合区, 而P9则为人端粒酶逆转录酶(hTERT)的隐性表位异形肽P572Y(YLFFYRKSV). 多肽经中压液相色谱纯化, 高压液相色谱鉴定, 其纯度达到国际多肽试验标准; 相对分子质量以质谱鉴定, 经质谱算法测定M为3 528, 与理论计算值基本相符, 证实合成纯化产物为目标多肽K₁₈P₉(图1). PCR扩增人GM-CSF, 产物大小与预期453 bp相符(泳道1), 并经BglⅡ和EcoRⅠ消化后克隆于双表达载体pTCAE相应位点, 产生重组质粒pTG. hTERT SalⅠ经和BglⅡ酶切, 回收片段为3 453 bp, 与预期相符(泳道4), 将其克隆入pTG的SalⅠ和BamHⅠ(BglⅡ的同尾酶)之间, 产生重组质粒pTGH. pTG和pTGH经BglⅡ和EcoRⅠ酶切鉴定(泳道3、2), pTG所得片段大小与hGM-CSF一致, pTGH所得片段分别为6 398 bp, 3 453 bp(泳道4)、726 bp和453 bp(泳道1), 与预期一致. pTGH中hGM-CSF和hTERT测序分别与Genebank中人GM-CSF和TERT序列一致(数据未列出), 证实pTGH构建成功. 采用DNA阻滞试验分析不同量多肽与DNA发生完全阻滞质粒泳动所需的最小r值(图3), 当r<2时, 阳离子肽-核酸疫苗的泳动被部分阻滞, 随着r值的逐渐增大, 泳动的聚合物数量迅速减少, 滞留在加样孔中的疫苗的DNA量相应增多. r>2时, 聚合物被完全阻滞, 提示质粒DNA被充分包装所需的最小r值为2. 以DNaseⅠ保护试验分析聚合物中多肽有效保护质粒DNA, 避免受DNase酶降解所需的最小r值(图4), 当r = 0时, 游离的DNA被DNA酶完全降解; 当r = 0.5和1.0时, 质粒DNA不能被阳离子肽有效保护; 但随着r值的增大被DNaseⅠ酶解的片段有所增大, 保护效应逐渐增加, 在r≥2.0时出现了完全保护的DNA条带, 因此确定DNA有效保护所需最小r值为2.

图1 K₁₈P₉的高压液相色谱鉴定.

图2 质粒pTGH的鉴定.

图3 DNA凝胶阻滞分析.

图4 DNaseⅠ保护试验.

2.1 细胞转染与表达分析

为鉴定肽-DNA聚合物在体外对哺乳细胞的转染效应以及双表达质粒编码hGM-CSF和hTERT表达后的免疫原性, 分别以r值为0, 1, 2, 4, 8的疫苗转染COS-7, 以DOTAP法转染裸质粒pTGH作为阳性对照, 通过ELISA法检测转染细胞上清中的GM-CSF的表达量, 从而评价其转染效应; 同时采用Western杂交分析hTERT表达的有效性. 结果发现当r = 4时, 可见有较高水平的GM-CSF表达, 即此时转染效率最高, 与阳性对照DOTAP组比较, 疫苗转染效率约为其78.5％, 当r为2或8时, GM-CSF表达水平明显下降. 本实验证实了双表达质粒编码的GM-CSF基因和hTERT基因均能在真核细胞内有效表达, 有望诱导较理想的免疫应答.

2.2 疫苗颗粒透射电镜分析

VPNV能否通过细胞核膜是基因表达的关键环节. 以r = 2.0时制备疫苗, 质粒DNA被阳离子肽充分包裹, 能有效抵抗DNA酶的降解, 这时才具备基因转染的能力, 但电镜下直径较大, 致使其转染效率较低, 因此相应细胞上清中的GM-CSF水平也较低; 当r = 4.0时, 形成的病毒样颗粒呈大小均一的近圆形颗粒, 且直径较小, 约10-40 nm, 绝大多数颗粒直径<25 nm, 如图5显示. 当r = 8时, 因过多的多肽包裹DNA, 使颗粒的直径更小而致密.

图5 r = 4时VPNV透射电镜照片.

３ 讨论

阳离子肽类DNA转运载体(cationic peptides DNA delivery systems)是基因治疗领域中一类倍受关注的技术[23-28], 他由一些富含正电荷氨基酸的多肽组成, 可通过电性中和作用与富含负电荷的质粒DNA发生聚合并压缩, 可将直径约数百纳米且松散的质粒DNA缩聚成几十纳米的致密颗粒, 从而易于被真核细胞摄入, 并可保证DNA不被核酸酶降解, 以达到基因转染的目的. 我们以端粒酶逆转录酶hTERT为靶标, 合成其隐性表位异形肽P572Y加多聚赖氨酸的多肽, 并制备含有编码hTERT和hGM-CSF基因的双表达真核质粒, 使二者结合形成一种新型的病毒样颗粒肽-核酸疫苗VPNV. 当二者正负电荷的比值r≥2后, 在DNA阻滞试验中阳离子抗原肽一方面中和了DNA的电荷; 另一方面, 使DNA分子在电场中泳动的阻力增加, 从而有效包装质粒DNA; 同时也保护质粒DNA免受DNaseⅠ的破坏. 有关阳离子肽类DNA转运载体的研究表明, 阳离子肽与质粒DNA的结合, 取决于多肽内含赖氨酸等碱性氨基酸的数目、多肽长度及其在溶液中的构象等因素, 还与所在溶液的离子强度有关[29,30]. VPNV经负染后裸质粒可见结构松散的闭环质粒分子, 缠绕折叠呈不规则形, 骨架疏松呈灰黑色高密度影, 此因质粒分子内部附着较多染料钨盐所致; 随着多肽/核酸比例增加, 二者形成的聚合物就越致密, 最终形成直径约几十纳米的致密圆形颗粒, 结构致密呈低密度影(灰白色), 其周围则为高密度影(灰黑色), 此因多肽和质粒聚缩成内部空隙少的致密颗粒, 无法附着钨盐, 而周围的碳膜上却吸附了相对较多的钨盐故呈高密度影. 这种因电性中和作用而形成的致密颗粒, 将有利于被抗原递呈细胞摄入加工[31]. 结合DNA阻滞实验、电镜以及体外转染效应试验的结果分析: 当r = 2时, 多肽可完全中和质粒的负电荷, 并形成聚合物, 此时才具备基因转染的能力, 但此时聚合物较松散, 直径较大(电镜); 当r = 4.0时, VPNV较易于被细胞摄入, 进入胞内的VPNV在溶酶体中被蛋白酶降解, 可释放出质粒DNA, 部分DNA可转移入胞质和胞核内, 进而被转录和·译, 由此出现较高的转染效率, 相应细胞上清中也可检测到较高水平的GM-CSF; 当r = 8.0时, 颗粒更致密, 但这样的颗粒进入胞内后, 其中的质粒可能反而不易释放处理, 进而阻碍了GM-CSF的表达, 使得细胞上清中的GM-CSF水平降低. 基于上述结果, 决定了在下一步的疫苗制备中采用r = 4.0, 以保证该疫苗在体内具备一定的转染活性. 本研究为下一步研究体内诱发特异性CTL应答奠定了基础, 该疫苗将有望激发机体特异性抗肿瘤的免疫应答.

备注

电编: 张敏 编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

参考文献

1.	Yang SM, Fang DC, Luo YH, Lu R, Battle PD, Liu WW. Alter-ations of telomerase activity and terminal restriction fragment in gastric cancer and its premalignant lesions. J Gastroenterol Hepatol. 2001;16:876-882.  [PubMed]  [DOI]

2.	房 殿春, 罗 元辉, 杨 仕明, 鲁 荣, 门 荣甫, 刘 为纹. 大肠癌组织端粒酶活性的检测及其意义. 中华内科杂志. 1998;37:742-744.  [PubMed]  [DOI]

3.	房 殿春, 罗 元辉, 杨 仕明, 鲁 荣, 刘 为纹. 原发性肝癌端粒酶活性的检测及临床意义. 免疫学杂志. 1997;13:193-195.  [PubMed]  [DOI]

4.	杨 仕明, 房 殿春, 罗 元辉, 鲁 荣, 杨 金亮, 刘 为纹. 不同病变胃黏膜端粒酶活性及其亚单位的检测. 癌症. 2001;20:23-27.  [PubMed]  [DOI]

5.	陈 陵, 杨 仕明, 蔡 永国, 房 殿春, 李 晶晶, 罗 元辉. 针对端粒酶蛋白催化亚单位的肿瘤免疫治疗研究. 世界华人消化杂志. 2005;13:528-533.  [PubMed]  [DOI]

6.	Vonderheide RH. Telomerase as a universal tumor-associated antigen for cancer immunotherapy. Oncogene. 2002;21:674-679.  [PubMed]  [DOI]

7.	Vonderheide RH, Domchek SM, Schultze JL, George DJ, Hoar KM, Chen DY, Stephans KF, Masutomi K, Loda M, Xia Z. Vaccination of cancer patients against telomerase induces functional antitumor CD8+ T lymphocytes. Clin Cancer Res. 2004;10:828-839.  [PubMed]  [DOI]

8.	Frolkis M, Fischer MB, Wang Z, Lebkowski JS, Chiu CP, Majumdar AS. Dendritic cells reconstituted with human telo-merase gene induce potent cytotoxic T-cell response against different types of tumors. Cancer Gene Ther. 2003;10:239-249.  [PubMed]  [DOI]

9.	Amarnath SM, Dyer CE, Ramesh A, Iwuagwu O, Drew PJ, Greenman J. In vitro quantification of the cytotoxic T lymph-ocyte response against human telomerase reverse transcriptase in breast cancer. Int J Oncol. 2004;25:211-217.  [PubMed]  [DOI]

10.

Verra NC, Jorritsma A, Weijer K, Ruizendaal JJ, Voordouw A, Weder P, Hooijberg E, Schumacher TN, Haanen JB, Spits H. Human telomerase reverse transcriptase-trans-duced human cytotoxic T cells suppress the growth of human melanoma in immunodeficient mice. Cancer Res. 2004;64:2153-2161.  [PubMed]  [DOI]

11.	Gordan JD, Vonderheide RH. Universal tumor antigens as targets for immunotherapy. Cytotherapy. 2002;4:317-327.  [PubMed]  [DOI]

12.	Berzofsky JA, Terabe M, Oh S, Belyakov IM, Ahlers JD, Janik JE, Morris JC. Progress on new vaccine strategies for the imm-unotherapy and prevention of cancer. J Clin Invest. 2004;113:1515-1525.  [PubMed]  [DOI]

13.	Finn OJ. Cancer vaccines: between the idea and the reality. Nat Rev Immunol. 2003;3:630-641.  [PubMed]  [DOI]

14.	Boyd D, Hung CF, Wu TC. DNA vaccines for cancer. IDrugs. 2003;6:1155-1164.  [PubMed]  [DOI]

15.	Odunsi K, Lele S, Savalgi R. Vaccine therapy for cancer: fact or fiction? Surg Technol Int. 2004;13:39-47.  [PubMed]  [DOI]

16.	Radvanyi L. Discovery and immunologic validation of new antigens for therapeutic cancer vaccines. Int Arch Allergy Immunol. 2004;133:179-197.  [PubMed]  [DOI]

17.	Ribas A, Butterfield LH, Glaspy JA, Economou JS. Current developments in cancer vaccines and cellular immunotherapy. J Clin Oncol. 2003;21:2415-2432.  [PubMed]  [DOI]

18.	Gross DA, Graff-Dubois S, Opolon P, Cornet S, Alves P, Benna-ceur-Griscelli A, Faure O, Guillaume P, Firat H, Chouaib S. High vaccination efficiency of low-affinity epitopes in antitumor immunotherapy. J Clin Invest. 2004;113:425-433.  [PubMed]  [DOI]

19.	Scardino A, Gross DA, Alves P, Schultze JL, Graff-Dubois S, Faure O, Tourdot S, Chouaib S, Nadler LM, Lemonnier FA. HER-2/neu and hTERT cryptic epitopes as novel targets for broad spectrum tumor immunotherapy. J Immunol. 2002;168:5900-5906.  [PubMed]  [DOI]

20.

Hernandez J, Schoeder K, Blondelle SE, Pons FG, Lone YC, Simora A, Langlade-Demoyen P, Wilson DB, Zanetti M. Anti-genicity and immunogenicity of peptide analogues of a low affinity peptide of the human telomerase reverse transcriptase tumor antigen. Eur J Immunol. 2004;34:2331-2341.  [PubMed]  [DOI]

21.	Chang DZ, Lomazow W, Joy Somberg C, Stan R, Perales MA. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor: an adju-vant for cancer vaccines. Hematology. 2004;9:207-215.  [PubMed]  [DOI]

22.

Ullenhag GJ, Frodin JE, Mosolits S, Kiaii S, Hassan M, Bonnet MC, Moingeon P, Mellstedt H, Rabbani H. Immunization of colorectal carcinoma patients with a recombinant canarypox virus expressing the tumor antigen Ep-CAM/KSA (ALVAC-KSA) and granulocyte macrophage colony- stimulating factor induced a tumor-specific cellular immune response. Clin Cancer Res. 2003;9:2447-2456.  [PubMed]  [DOI]

23.	Chow YH, Huang WL, Chi WK, Chu YD, Tao MH. Impro-vement of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coex-pressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2. J Virol. 1997;71:169-178.  [PubMed]  [DOI]

24.	Liu G, Molas M, Grossmann GA, Pasumarthy M, Perales JC, Cooper MJ, Hanson RW. Biological properties of poly-L-lysine-DNA complexes generated by cooperative binding of the polycation. J Biol Chem. 2001;276:34379-34387.  [PubMed]  [DOI]

25.	Luo D, Saltzman WM. Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol. 2000;18:33-37.  [PubMed]  [DOI]

26.	Cho YW, Kim JD, Park K. Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol. J Pharm Pharmacol. 2003;55:721-734.  [PubMed]  [DOI]

27.	Thomas M, Klibanov AM. Non-viral gene therapy: polycation-mediated DNA delivery. Appl Microbiol Biotechnol. 2003;62:27-34.  [PubMed]  [DOI]

28.	Brown MD, Schatzlein AG, Uchegbu IF. Gene delivery with synthetic (non viral) carriers. Int J Pharm. 2001;229:1-21.  [PubMed]  [DOI]

29.	Vaysse L, Arveiler B. Transfection using synthetic peptides: comparison of three DNA-compacting peptides and effect of centrifugation. Biochim Biophys Acta. 2000;1474:244-250.  [PubMed]  [DOI]

30.	Ewert K, Slack NL, Ahmad A, Evans HM, Lin AJ, Samuel CE, Safinya CR. Cationic lipid-DNA complexes for gene therapy: understanding the relationship between complex structure and gene delivery pathways at the molecular level. Curr Med Chem. 2004;11:133-149.  [PubMed]  [DOI]

31.	Sheng KC, Pietersz GA, Wright MD, Apostolopoulos V. Den-dritic cells: activation and maturation-applications for cancer immunotherapy. Curr Med Chem. 2005;12:1783-1800.  [PubMed]  [DOI]