基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-09-28; 13(18): 2183-2187
在线出版日期: 2005-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i18.2183
细甘草甜素下调基质金属蛋白酶组织抑制因子-1基因的表达
王巧侠, 成军, 郭江, 李文凡, 魏红山
王巧侠, 兰州大学临床医学院 甘肃省兰州市 730000
成军, 郭江, 魏红山, 北京地坛医院传染病研究所 北京市 100011
李文凡, 甘肃省人民医院消化科 甘肃省兰州市 730000
王巧侠, 女, 1975-03-29生, 陕西省西安市人, 汉族, 住院医师, 兰州大学2003级传染病学硕士研究生, 主要从事慢性肝脏疾病发病机制的研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队九五科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队十五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队十五科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100011, 北京市东城区安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2005-07-05
修回日期: 2005-07-07
接受日期: 2005-07-08
在线出版日期: 2005-09-28

目的: 了解甘草甜素对基质金属蛋白酶组织抑制因子-1基因启动子活性的调节作用, 探讨甘草甜素的抗纤维化机制.

方法: 应用聚合酶链反应(PCR)扩增基质金属蛋白酶组织抑制因子-1基因启动子, 命名为TIMP-1P, 以T-A克隆法, 将TIMP-1P基因片段连入载体pGEM-Teasy. 将获得的质粒pGEMTeasy-TIMP-1P, 与报告质粒pCAT3-basic分别用NheI和XhoI 双酶切后构建TIMP-1启动子报告基因表达载体pCAT3-TIMP-1P, 以重组表达质粒pCAT3-TIMP-1P瞬时转染HepG2细胞, 4 h后以0.1 mmol甘草甜素刺激,48 h后收获细胞. 同时以转染pCAT3 -basic的HepG2细胞为阴性对照, 每组设复孔对照, 用酶联免疫吸附法(ELISA)检测标本在415 nm波长的吸光度值, 其数值反映细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达水平.

结果: 构建的报告基因表达载体pCAT3-TIMP-1P经过序列分析和酶切鉴定正确. 瞬时转染HepG2细胞后, pCAT3-basic的吸光度值为0.004±0.002, pCAT3-TIMP-1P为2.329±0.685, 经方差分析两者差异有统计学意义(F=26.075, P<0.05), pCAT3-TIMP-1在HepG2细胞中能够启动CAT的表达. 转染HepG2细胞的pCAT3-TIMP-1P经0.1 mmol甘草甜素刺激后, 其吸光度值为0.268±0.009, 同期未经甘草甜素刺激的pCAT3-TIMP-1P吸光度值为0.490±0.153, 方差分析两者差异有统计学意义(F=35.775, P<0.05).

结论: 甘草甜素可下调TIMP-1启动子的转录活性, 抑制TIMP-1的基因表达.

关键词: 甘草甜素; 基质金属蛋白酶组织抑制因子-1; 抗纤维化
引文著录: 王巧侠, 成军, 郭江, 李文凡, 魏红山. 细甘草甜素下调基质金属蛋白酶组织抑制因子-1基因的表达. 世界华人消化杂志 2005; 13(18): 2183-2187
Glycyrrhizin down-regulates expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-1
Qiao-Xia Wang, Jun Cheng, Jiang Guo, Wen-Fan Li, Hong-Shan Wei
Qiao-Xia Wang, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Jun Cheng, Jiang Guo, Hong-Shan Wei, Institute of Infectious Diseases, Ditan Hospital, Beijing 100011, China
Wen-Fan Li, Department of Gastroenterology, The People's Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation, No. C03011402, No. C30070689; Returned Scholarship of General Logistics Department of Chinese PLA, No. 98H038; the Key Technology Research and Development Program of Chinese PLA during the 9th Five-Year Plan Period, No. 98D063; the Key Technology Research and Development Program of Chinese PLA for Distinguished Young Scholars during the 10th Five-Year Plan Period, No. 01Q138; and the Scientific Research Program of Chinese PLA during the 10th Five-Year Plan Period, No. 01MB135.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Anwai Street, Dongcheng District, Institute of Infectious Diseases, 13 Ditan Park, Ditan Hospital, Beijing 100011, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: July 5, 2005
Revised: July 7, 2005
Accepted: July 8, 2005
Published online: September 28, 2005

AIM: To investigate the regulatory effect of glycyrrhizin on the tissue inhibitor of metalloproteinases-1(TIMP-1) expression and to explore its anti-fibrosis mechanism.

METHODS: The TIMP-1 promoter was amplified by polymerase chain reaction(PCR), and the product was named TIMP-1P. The TIMP-1P was cloned into pGEM-Teasy vector to obtain pGEM-Teasy-TIMP-1P, and then the product and pCAT3-basic vector were digested by NheI and XhoI to construct pCAT3-TIMP-1P. Then pCAT3-TIMP-1P was transfected into HepG2 cells and the cells were treated with 0.1 mmol glycyrrhizin for 48 h. The HepG2 cells transfected with pCAT3-basic were used as negative controls. The expression level of chloramphenicol acetyltransferase(CAT) in HepG2 cells was detected by enzyme-linked immunoassay (ELISA).

RESULTS: The expressive vector pCAT3-TIMP-1P was constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. The optical density(OD) of the cells transfected with pCAT3-TIMP-1P was significantly higher than that with pCAT3-basic(2.329±0.685 vs 0.004±0.002, F =26.075, P < 0.05). After treatment with glycyrrhizin, the expression of CAT in the HepG2 cells transfected with pCAT3-TIMP-1P was notably decreased as compared with that in the same cells without glycyrrhizin treatment(OD: 0.268±0.009 vs 0.490±0.153, F =35.775, P < 0.05).

CONCLUSION: Glycyrrhizin can down-regulate the activity of TIMP-1 gene promoter as well as inhibit the expression of TIMP-1.

Key Words: Glycyrrhizin; Tissue inhibitor of metalloproteinases-1; Anti-fibrosis
0 引言

甘草甜素(GLglycyrrhizin GL)药理作用广泛, 能抑制肝脏炎症反应, 强有力地保护肝细胞膜, 增强肝脏的解毒功能, 减轻肝脏的病理性损害, 提高肝细胞对化学伤害的抵抗力, 促进胆红素代谢, 降低转氨酶, 逆转肝纤维化, 并抑制多种病毒的复制[1,2]. 肝星状细胞的活化和增殖是肝纤维化、肝硬化发病机制的重要环节, 肝星状细胞表达产生的胶原和非胶原糖蛋白在肝脏中沉积, 逐渐发展为肝纤维化、肝硬化[3-5]. 另外, 肝脏中的胶原和非胶原糖蛋白的降解速度也是决定肝纤维化发生发展的重要因素[6,7]. 研究表明, 基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1, TIMP-1)在肝脏中的细胞外基质降解调解过程中具有决定性的意义[8]. 临床观察和实验研究已经发现GL具有显著的抗肝纤维化作用[9-12], 但是GL是否是通过对TIMP-1基因表达的调节达到抗纤维化的目的一直不十分清楚. 我们通过观察GL对TIMP-1基因表达的影响, 探讨其抗肝纤维化的作用机制.

1 材料和方法
1.1 材料

人肝肿瘤细胞系HepG2细胞及大肠杆菌DH 5α菌株为本室保存. Tag DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶及限制性内切酶均购自Takara公司. 质粒DNA提取试剂盒, 中间载体pGEM-Teasy及报告质粒pCAT3-basic均购自Promega公司; CAT-ELISA检测试剂盒及质粒DNA转染试剂盒购自Roche公司. 玻璃奶纯化试剂盒购自博大公司, 其它生化试剂购自Sigma公司.

1.2方法

根据文献[13]合成引物, 上游引物P1: 5'- GCT AGC AGA ACC GGT ACC CAT CTC AG- 3'.下游引物P2: 5'- CTC GAG CTG TAC CTC TGG TGT CTC TC - 3', 在上下游引物的5'-端分别引入NheI和XhoI单一酶切位点, 引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成. 以HepG2细胞基因组DNA为模板, PCR扩增TIMP-1基因启动子800bp的DNA片段, PCR产物经9g∕L琼脂糖凝胶电泳, 切胶, 玻璃奶法回收纯化. 以T-A克隆法, 用T4 DNA连接酶将TIMP-1P基因片段连入载体pGEM-Teasy, 转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞, 筛选在选择平皿(Amp, X-gal/IPTG)生长的白色菌落提取质粒, 酶切(NheI/XhoI)及DNA测序鉴定, DNA测序由上海华诺生物科技有限公司完成. 将获得的质粒pGEMTeasy-TIMP-1 P和报告质粒pCAT3-basic分别用NheI和XhoI双酶切后用T4 DNA连接酶进行定向连接, 产物转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞, 筛选抗氨苄青霉素阳性菌落; 碱裂解法提取质粒, 再次双酶切(NheI/XhoI)及PCR鉴定正向插入克隆, 命名为pCAT3-TIMP-1P, 磁珠法提取质粒以备转染. HepG2细胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM中培养. 于35 mm平皿中生长至50%-80%融合时采用脂质体转染法, 转染方法参照FuGENE6 Transfection Reagent说明书进行. pCAT3-TIMP-1P转染剂量为1 μg, 设置pCAT3-basic 1μg为阴性对照, pCAT3-control 1μg为阳性对照, 每组设复孔对照. 转染48 h后收获细胞, 收集细胞裂解液, 用于CAT活性检测以验证克隆的DNA片断具有启动子活性. 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至50%-80%融合时转染pCAT3-TIMP-1P 1 μg, 于转染后4 h换液时加入GL使终浓度为0.1 mmol, 同时以转染pCAT3-Basic的HepG2细胞作阴性对照, 以转染pCAT3-control的HepG2细胞为阳性对照. 转染48 h后, 收集细胞裂解液, 用于CAT表达水平检测. 检测方法按照试剂盒说明书进行. 取1.0 μg/L 的CAT标准品(试剂盒提供)及细胞裂解液200 μL加入已包被抗体的96孔板中, 37 ℃温育1 h, 再依次加入一抗(地高辛标记的抗-CAT)、二抗(偶联有过氧化物酶的地高辛抗体anti-Dig-Pod)各200 μL, 37 ℃温育1 h后, 加入过氧化物酶的底物室温显色10-30 min. 用酶标仪检测标本在415 nm波长的吸光度值, 其数值反映细胞提取物中的CAT表达水平. 以未作转染的细胞裂解液平行实验作空白对照.

统计学处理 数据以mean±SD表示, 用SSPS11.0统计学软件进行方差分析.

2 结果

成功扩增出TIMP-1基因的启动子序列, 经9 g∕L琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约800 bp, 与预期片段符合(图1).构建的中间载体pGEM-Teasy-TIMP-1p以NheI/XhoI双酶切鉴定, 9 g∕L琼脂糖凝胶电泳分析显示两条带(3015 bp的pGEM-Teasy载体和800 bp的TIMP-1启动子DNA片段), 与预期一致(图2). DNA测序证实重组质粒含有800 bp的目的基因, 读码框架正确. 将双酶切产物与pCAT3-basic载体连接, 以NheI/XhoI双酶切鉴定, 9g∕L琼脂糖凝胶电泳分析显示两条带(4022 bp的pCAT3-basic载体和800 bp的TIMP-1启动子DNA片段)(图3), 说明重组质粒pCAT3-TIMP-1p构建正确(图4). 将重组质粒pCAT3-TIMP-1p转染HepG2细胞, CAT ELISA检测吸光度, 空载体对照组pCAT3-Basic的吸光度为0.004±0.002, 阳性对照组为pCAT3-control为2.029±0.650, pCAT3-TIMP-1p为2.329±0.685 (图5), F=26.075(P<0.05＝差异有统计学意义(表1), 表明pCAT3-TIMP-1p具有很强的启动子活性. 以GL刺激转染了pCAT3- TIMP-1p的HepG2细胞, 当pCAT3-TIMP-1p单独转染时, 其吸光度值为0.490±0.153, 加入0.1 mmolGL刺激后吸光度值为0.268±0.009, 空载体对照组pCAT3-basic的吸光度值为0.003±0.002, GL刺激转染pCAT3-TIMP-1p的 CAT吸光度值表达明显降低, F =35.775(P<0.05＝差异有统计学意义(表2), 说明GL对TIMP-1p基因启动子有下调作用 (图6).

表1 质粒转染HepG2的CAT吸光度值.
组别A415 nm
pCAT3-basic0.004 ± 0.002
pCAT3-control2.029 ± 0.650a
pCAT3-TIMP-1p2.329 ± 0.685a
aP < 0.05, F =26.075 vs pCAT3-basic.
图1
图1 以HepG2基因组DNA为模板, PCR扩增TIMP-1启动子序列.
表2 GL刺激pCAT3-TIMP-1p的CAT吸光度值.
组别A415nm
pCAT3-basic0.003 ± 0.002
pCAT3-control1.058 ± 0.313a
pCAT3-TIMP-1p0.490 ± 0.153a
GL + pCAT3-TIMP-1p0.268± 0.009b
aP < 0.05, vs pCAT3-basic,
bP < 0.05, F=35.775 vs pCAT3-TIMP-1p.
图2
图2 pGEM-Teasy-TIMP-1p双酶切鉴定(NheI/XhoI).
图3
图3 pCAT3-TIMP-1p双酶切鉴定(NheI/XhoI).
图4
图4 pCAT3-TIMP-1p双酶切鉴定(NheI/XhoI).
图5
图5 pCAT3-TIMP-1p转染HepG2细胞 CAT表达.
图6
图6 甘草甜素刺激pCAT3-TIMP-1p后CAT表达.
3 讨论

正常情况下, 细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成与降解通过基质金属蛋白酶(MMP)及其抑制剂(TIMP)的相互作用而维持一个平衡的状态, 并得到十分精确的调控[14,15]. 在各种病因造成的肝损伤过程中, ECM合成与降解之间的平衡被打破, 以胶原为主的ECM各成分过多沉积在肝内引起纤维化, 如果进一步发展造成肝小叶重建, 假小叶和结节形成, 则进入肝硬化[16]. 许多实验研究表明, 在肝损伤早期, MMP一度升高, 但随着肝纤维化及肝硬化的发展, TIMP活性持续增高, 抑制了MMP的活性, 因而学者们认为TIMP是肝纤维化发生过程中的一个非常重要的促发因素[17-19]. TIMP是一组抑制基质金属蛋白酶活性的多功能因子家族, 目前已发现TIMP1,2,3,4 四个成员, TIMP-1是调节肝内ECM 沉积的重要因素, 主要通过抑制MMP对ECM的降解使ECM 在肝脏内沉积增加, 也可通过抑制已活化的星状细胞的凋亡使得星状细胞持续活化, 而加剧肝内的ECM形成和堆积, 促进了肝硬化的形成[20-26]. GL是从中药甘草中提取的有效成分, 该药抗纤维化的机制不清楚. 近年来有学者发现GL有减少纤维化动物Ⅰ型胶原含量, 抑制培养细胞I, III型前胶原mRNA的表达的作用[27]. 并且多项研究提示该药可能通过抗细胞毒性作用、免疫调节以及影响多种因子的信号转导而发挥抗肝纤维化作用[28-31]. 采用基因重组技术构建pCAT3-TIMP-1P报告基因载体, 瞬时转染人肝肿瘤细胞系HepG2细胞后以0.1 mmol GL刺激, 用酶联免疫吸附法(ELISA)测得下游CAT基因的表达降低, 证明GL可下调TIMP-1启动子活性, 进而抑制TIMP-1基因的表达. 说明人和动物应用GL后, 通过对TIMP-1表达的直接抑制从而达到其抗纤维化作用. 这些结果为深入了解GL的抗纤维化机制提供了新的理论依据.

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

1.  Ohtake N, Nakai Y, Yamamoto M, Sakakibara I, Takeda S, Amagaya S, Aburada M. Separation and isolation methods for analysis of the active principles of Sho-saiko-to (SST) oriental medicine. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004;812:135-148.  [PubMed]  [DOI]
2.  Miyazawa N, Takahashi H, Yoshiike Y, Ogura T, Watanuki Y, Sato M, Kakemizu N, Yamakawa Y, U CH, Goto H. [Effect of glycyrrhizin on anti-tuberculosis drug-induced hepatitis]. Kekkaku. 2003;78:15-19.  [PubMed]  [DOI]
3.  饶 慧瑛, 魏 来. 肝星状细胞的生物学特性及活化调控机制. 世界华人消化杂志. 2005;13:671-674.  [PubMed]  [DOI]
4.  黄 瑾, 张 锦生. 肝星状细胞活化的启动、维持和调控. 国外医学消化性疾病分册. 2002;22:227-230.  [PubMed]  [DOI]
5.  周 俊英, 甄 真, 姚 树坤. 肝星状细胞凋亡与肝纤维化逆转. 国外医学内科学分册. 2004;31:403-406.  [PubMed]  [DOI]
6.  Jia JD. [Recent advances in the pathogenesis, diagnosis and treatment of hepatic fibrosis]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2004;12:257-258.  [PubMed]  [DOI]
7.  徐 斌, 张 振华, 黄 祝青. 血清基质金属蛋白酶及其组织抑制因子与肝纤维化. 实用肝脏病杂志. 2004;7:56-58.  [PubMed]  [DOI]
8.  郑 伟达, 王 小众, 张 莉娟, 史 美娜, 陈 治新, 陈 运新, 黄 月红. TIMP-1表达在实验性大鼠肝纤维化发病中的作用. 胃肠病学和肝 病学杂志. 2004;13:475-478.  [PubMed]  [DOI]
9.  Zhang QS, Yuan RH, Zhang J, Tian GY. [Targeted glycyrrhetinic acid to receptors of hepatic stellate cells for the treatment of rat liver fibrosis: a pilot study]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2004;12:512.  [PubMed]  [DOI]
10.  Zhang YF, Wang LL, Yin WH. [Clinical observation on the anti-liver fibrosis treatment by diammonion glycyrrhizinate injection combined with salvia]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2002;22:538-539.  [PubMed]  [DOI]
11.  Kumada H. Long-term treatment of chronic hepatitis C with glycyrrhizin [stronger neo-minophagen C (SNMC)] for preventing liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Oncology. 2002;62 Suppl 1:94-100.  [PubMed]  [DOI]
12.  Chen MH, Chen JC, Tsai CC, Wang WC, Chang DC, Lin CC, Hsieh HY. Sho-saiko-to prevents liver fibrosis induced by bile duct ligation in rats. Am J Chin Med. 2004;32:195-207.  [PubMed]  [DOI]
13.  Lee M, Song SU, Ryu JK, Suh JK. Sp1-dependent regulation of the tissue inhibitor of metalloproteinases-1 promoter. J Cell Biochem. 2004;91:1260-1268.  [PubMed]  [DOI]
14.  Lichtinghagen R, Bahr MJ, Wehmeier M, Michels D, Haberkorn CI, Arndt B, Flemming P, Manns MP, Boeker KH. Expression and coordinated regulation of matrix metalloproteinases in chronic hepatitis C and hepatitis C virus-induced liver cirrhosis. Clin Sci (Lond). 2003;105:373-382.  [PubMed]  [DOI]
15.  高 春芳. 胶原基因转录调控与纤维化. 世界华人消化杂志. 2005;13:166-171.  [PubMed]  [DOI]
16.  郑 伟达, 王 小众. 基质金属蛋白酶及其抑制物与实验性肝纤维化. 世界华人消化杂志. 2004;12:428-431.  [PubMed]  [DOI]
17.  张 洁, 陈 晓宇, 彭 延申, 李 继强. 大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝组织MMP-13及TIMP-1表达变化与肝纤维化的关系. 世界华人消化杂志. 2005;13:512-515.  [PubMed]  [DOI]
18.  李 保森, 游 绍莉, 赵 志海, 辛 绍杰, 赵 景民, 王 松山. 实验性肝纤维化形成过程中几种基质金属蛋白酶表达的研究. 世界华人消化杂志. 2003;11:483-485.  [PubMed]  [DOI]
19.  Zhu YK, Wang BE, Shen FJ, Wang AM, Jia JD, Ma H. [Dynamic evolution of MMP-13, TIMP-1, type I and III collagen and their interaction in experimental liver fibrosis]. Zhonghua Ganzangbing Zazhi. 2004;12:612-615.  [PubMed]  [DOI]
20.  Herrmann J, Arias M, Van De Leur E, Gressner AM, Weiskirchen R. CSRP2, TIMP-1, and SM22alpha promoter fragments direct hepatic stellate cell-specific transgene expression in vitro, but not in vivo. Liver Int. 2004;24:69-79.  [PubMed]  [DOI]
21.  Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Ikenaka Y, Noguchi R, Nakatani T, Tsujinoue H, Yanase K, Namisaki T, Imazu H. Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 attenuates spontaneous liver fibrosis resolution in the transgenic mouse. Hepatology. 2002;36:850-860.  [PubMed]  [DOI]
22.  Murphy FR, Issa R, Zhou X, Ratnarajah S, Nagase H, Arthur MJ, Benyon C, Iredale JP. Inhibition of apoptosis of activated hepatic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition: implications for reversibility of liver fibrosis. J Biol Chem. 2002;277:11069-11076.  [PubMed]  [DOI]
23.  Murphy F, Waung J, Collins J, Arthur MJ, Nagase H, Mann D, Benyon RC, Iredale JP. N-Cadherin cleavage during activated hepatic stellate cell apoptosis is inhibited by tissue inhibitor of metalloproteinase-1. Comp Hepatol. 2004;3 Suppl 1:S8.  [PubMed]  [DOI]
24.  聂 青和, 谢 玉梅, 周 永兴, 程 勇前, 罗 红, 罗 新栋. 正常及实验性肝纤维化大鼠肝脏中的金属蛋白酶组织抑制因子-1. 世界华 人消化杂志. 2003;11:204-208.  [PubMed]  [DOI]
25.  Flisiak R, Maxwell P, Prokopowicz D, Timms PM, Panasiuk A. Plasma tissue inhibitor of metalloproteinases-1 and transforming growth factor beta 1--possible non-invasive biomarkers of hepatic fibrosis in patients with chronic B and C hepatitis. Hepatogastroenterology. 2002;49:1369-1372.  [PubMed]  [DOI]
26.  Nie QH, Duan GR, Luo XD, Xie YM, Luo H, Zhou YX, Pan BR. Expression of TIMP-1 and TIMP-2 in rats with hepatic fibrosis. World J Gastroenterol. 2004;10:86-90.  [PubMed]  [DOI]
27.  Zhang Q, Wang J, Hu M. [Effects of glycyrrhetinic acid and IFN-alpha on HSCs collagen metabolism in rat fibrotic liver of varying stages]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2002;10:72-73.  [PubMed]  [DOI]
28.  Kinjo J, Hirakawa T, Tsuchihashi R, Nagao T, Okawa M, Nohara T, Okabe H. Hepatoprotective constituents in plants. 14. Effects of soyasapogenol B, sophoradiol, and their glucuronides on the cytotoxicity of tert-butyl hydroperoxide to HepG2 cells. Biol Pharm Bull. 2003;26:1357-1360.  [PubMed]  [DOI]
29.  Cai Y, Shen XZ, Wang JY. [Effects of glycyrrhizin on genes expression during the process of liver fibrosis]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2003;83:1122-1125.  [PubMed]  [DOI]
30.  刘 妍, 成 军, 杨 倩, 王 建军, 纪 冬, 王 春花, 党 晓燕, 徐 志强. 应用基因表达谱芯片技术克隆甘草甜素诱导Jurkat细 胞后的差异表达基因. 世界华人消化杂志. 2004;12:70-73.  [PubMed]  [DOI]
31.  王 建军, 李 宝伟, 成 军, 刘 妍, 徐 志强, 杨 倩, 纪 冬, 党 晓燕, 王 春花. 表达谱基因芯片技术研究甘草甜素上调白细胞 介素-18基因的表达. 世界华人消化杂志. 2004;12:855-858.  [PubMed]  [DOI]