研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-09-15; 13(17): 2138-2141
在线出版日期: 2005-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i17.2138
二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化模型中库普弗细胞与星状细胞的分布
朴金花, 金京顺, 崔京淑, 朴东明
朴金花, 金京顺, 崔京淑, 朴东明, 延边大学医院病理科 吉林省延吉市 133000
通讯作者: 朴东明, 133000, 吉林省延吉市局子街119号, 延边大学医院病理科. pdm11172000@yahoo.com.cn
电话: 0433-2660121 传真: 0433-2513610
收稿日期: 2005-08-03
修回日期: 2005-08-07
接受日期: 2005-08-10
在线出版日期: 2005-09-15

目的: 探讨二甲基亚硝胺(DMN)诱发大鼠肝纤维化库普弗细胞(kupffer cell, KC)与肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的分布及意义.

方法: 用10 g/L DMN腹腔注射4 wk制备大鼠肝纤维化模型, 实验第4、7周末检测大鼠血清ALT、AST活性及总蛋白(total proteins, TP)含量, 测定肝/体质量比及肝组织胶原纤维的面密度、观察肝组织的病理变化, 免疫组化采用SP法观察KC和HSC标志物ED1及α-SMA的表达及分布.

结果: 第4周模型组与正常组比较血清ALT、AST活性显著升高(P<0.01), TP含量和肝/体质量比明显下降(P<0.01), 肝组织内胶原纤维面密度明显升高, 大部分形成弥漫性肝硬化；第7周模型组除了血清TP含量无变化外ALT、AST活性仍维持较高水平, 并维持肝硬化的特点.免疫组化染色第4、7周模型组ED1和α-SMA阳性细胞数量明显增加, 两种细胞分布的部位相同, 主要在增生的纤维组织及纤维间隔弥漫分布, 在肝实质内少量散在分布.

结论: DMN引起大鼠肝功能明显障碍, 大部分形成弥漫肝硬化, KC与HS的分布表明KC与激活、活化HSC密切相关.

关键词: 二甲基亚硝胺; 肝纤维化; 大鼠; 肝星状细胞; Kupffer细胞
引文著录: 朴金花, 金京顺, 崔京淑, 朴东明. 二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化模型中库普弗细胞与星状细胞的分布. 世界华人消化杂志 2005; 13(17): 2138-2141
Distribution of Kupffer cells and hepatic stellate cells in dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in rats
Jin-Hua Piao, Jing-Shun Jin, Jing-Shu Cui, Dong-Ming Piao
Jin-Hua Piao, Jing-Shun Jin, Jing-Shu Cui, Dong-Ming Piao, Department of pathology, Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin Province, China
Correspondence to: Dong-Ming Piao, Department of pathology, Hospital of Yanbian University, 119 Juzi Street, Yanji 133000, Jilin Province, China. pdm11172000@yahoo.com.cn
Received: August 3, 2005
Revised: August 7, 2005
Accepted: August 10, 2005
Published online: September 15, 2005

AIM: To investigate the distribution and significance of Kupffer cells (KCs) and hepatic stellate cells (HSCs) in dimethylnitrosamine(DMN)-induced liver fibrosis in rats.

METHODS: Rat liver fibrosis was induced by peritoneal injection of DMN (10 g/L) for 4 wk. The activities of serum alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), the contents of total proteins (TP), the ratio of liver/body weight and the area density of collagenous fiber were examined 4 and 7 wk after injection. Meanwhile, the pathological changes of the liver tissues were observed under light microscope. The expression of ED1 and α-smooth muscle actin (α-SMA) were detected by immunohistochemical SP method.

RESULTS: Compared with those in the control group, the levels of ALT and AST were significantly elevated 4 and 7 wk after injection (4 wk: 1201.91±215.04, 5741.15±1000.20 nkat/L vs 398.91±106.35, 1365.27±435.09 nkat/L, P <0.01; 7 wk: 745.15±413.42, 2355.47±1418.62 nkat/L vs 289.72±43.01, 1018.54±215.04 nkat/L, P <0.05). TP content was significantly decreased 4 wk after injection (50.32±9.81 g/L vs 69.67±6.09 g/L, P <0.01), but returned to normal after 7 wk. The ratio of liver/body weight was decreased (4 wk: 2.156±0.539% vs 2.950±0.147%, P <0.01; 7 wk: 2.250±0.638% vs 2.863±0.158%, P <0.01), but the area density of collagenous fiber was increased 4 and 7 wk after injection (9.90±1.93% vs 1.27±0.28%, P <0.01; 9.20±0.97% vs 1.46±0.67%, P <0.01). Diffuse cirrhosis was observed in most model rats after 4 wk and it was still significant after 7 wk. The ED1 and α-SMA positive cells aggregated prominently in the fibrotic tissue and septa in the model rats.

CONCLUSION: DMN induces obviously liver disfunction and diffuse cirrhosis in rats, and KCs are closely associated with the activation of HSCs.

Key Words: Dimethylnitrosamine; Liver fibrosis; Rats; Hepatic stellate cell; Kupffer cell
0 引言

在各种原因引起肝脏疾病时,库普弗细胞(kupffer cell, KC)可在内毒素的介导下产生多种细胞因子,通过多种机制参于肝纤维化的调控, 其中心环节是激活肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC).近10多年来国内外利用二甲基亚硝胺(DMN)研究大鼠肝纤维化的报道较多,但有关该模型肝KC与HSC的研究报道甚少.本实验用DMN制备大鼠肝纤维化模型, 观察KC和HSC的表达, 探讨肝纤维化形成过程中两种细胞的分布及意义.

1 材料和方法
1.1 材料

Wistar♂大鼠32只, 清洁级, 体质量160-180 g (延边大学实验动物中心提供).血清ALT、AST及TP检测试剂盒购自Eiken Chemical(Tokyo, Japan)公司；DMN购自美国Sigma公司；直接红(Direct Red 80)购自美国Aldrich Chem公司；免疫组化试剂: Mouse抗Rat ED1是英国Serotec公司产品, 单克隆鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是Dako公司Denmark产品,SP试剂盒购自北京中山生物技术公司.

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备: 参照Matsuda et al[1]的方法, 实验动物随机分为2组, 模型组(n = 20): 10 g/L DMN(生理盐水稀释)1 mL/kg连续3 d/wk,腹腔内注射共4 wk.正常组(n = 12): 注射用生理盐水1 mL/kg连续3 d/wk, 腹腔内注射共4 wk.实验第4、7周末模型组各选10只、正常组各选6只大鼠, 测定体质量后用乙醚麻醉, 心脏采血离心处理.

1.2.2 血清生化指标的测定: 血清ALT、AST活性测定采用Reiman氏方法, TP含量采用Biuret法, 严格按Kit说明书进行操作, 利用分光光度计(Uitraspec 4050, LKB, Switzerland)测定吸光度, 对照标准曲线计算AST、ALT活性和TP的含量.

1.2.3 病理学检查: 肝/体质量百分比: 采血后立即取肝脏称质量, 计算肝/体质量百分比.病理学观察: 取肝左叶组织经40 g/L中性甲醛固定, 常规石蜡包埋切片, 行HE染色光镜下观察肝组织的病理变化: 直接红染色(1 g/L直接红苦味酸饱和液) 观察纤维组织的增生程度, 并利用彩色病理图象分析系统 (CMIAS,北京航空航天大学)检测胶原纤维的面密度.观察条件: 物镜4倍, 每张切片随机选4个视野, 图象采集、分割处理, 参数统计分析, 得出目标总面积/统计场总面积之比值.免疫组织化学染色﹕切片厚4-5μm, 常规脱蜡至水,用SP法进行免疫组织化学染色,ED1工作浓度为1∶500,α-SMA工作浓度为1∶50.

统计学处理 资料采用SPSS10.0软件进行统计学分析,P<0.05为有统计学意义.

２ 结果

2.1 模型制备过程第3周时模型组大鼠死亡1只, 第7周时死亡2只.第4周模型组血清ALT和AST活性明显升高,TP含量明显下降(P<0.01)；第7周模型组血清ALT及AST仍维持较高水平(P<0.05),TP含量与正常组相似；第4、7周模型组肝/体质量比明显下降(P<0.01), 胶原纤维面密度明显增加(P<0.01,表1).

表1 实验第4 wk、7 wk末各项指标的检测结果.
时间组别ALT(nkat/L)AST(nkat/L)TP(g/L)肝/体质量比(%)面密度(%)
4 wk正常组398.91±106.351365.27±435.0969.67±6.092.950±0.1471.27±0.28
模型组1201.91±215.04b5741.15±1000.20b50.32±9.81b2.156±0.539b9.90±1.93b
7 wk正常组289.72±43.011018.54±215.0463.56±4.552.863±0.1581.46±0.67
模型组745.15±413.42a2355.47±1418.62a63.10±5.692.250±0.638b9.20±0.97b
aP<0.05,
bP<0.01 vs 正常组.
2.2 病理学变化

正常组肝小叶结构正常, 无变性、坏死及出血,汇管区见少量纤维组织.第4周模型组肝小叶结构紊乱, 肝细胞变性、灶状或片状坏死, 汇管区内大量纤维组织增生, 并形成较粗的纤维间隔深入肝组织内形成大小不等的假小叶(7/9).第7周肝组织病理变化较第4周略减轻,但仍维持肝硬化的特点(7/8).免疫组化染色结果: 正常组ED1阳性细胞在汇管区、中央静脉周围和肝实质内少量散在分布；在中央静脉壁有少量α-SMA阳性表达, 汇管区各种血管壁阳性表达, 肝细胞间无阳性细胞.模型组第4、7周肝组织内KC(ED1+)和HSC(α-SMA+)数量明显增多, 两种细胞分布的部位相同, 主要在增生的纤维组织及纤维间隔弥漫分布, 在肝实质内少量散在分布(图1-2).

图1
图1 第4周模型组(×100). A: α-SMA; B: ED-1.
图2
图2 第7周模型组(×100). A: α-SMA; B: ED-1.
3 讨论

DMN是一种具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的化学物质, 小剂量长期给药可发生肝肿瘤, 大剂量发生肝细胞坏死和肝纤维化, 给药途径主要是腹腔内注射.实验动物腹腔注射DMN 4 wk后形成与人酒精性肝硬化相似的病理所见.CCl4诱发大鼠肝纤维化的模型在停止攻击后有自然恢复的倾向, 但DMN模型有停药后仍维持肝硬化几个月的特点[2-3].

本实验第4周模型组与正常组比较, 血清ALT、AST活性明显升高, TP含量明显下降, 表明肝功能损伤严重,第7 wk末除TP含量无明显变化以外, ALT、AST活性仍维续较高水平, 表明肝功能损伤仍较明显, 与陈文慧 et al[4]报道相似.第4周模型组肝/体质量比明显减少, 胶原纤维面密度明显增高；病理学观察表明肝细胞排列紊乱, 失去正常结构, 汇管区大量纤维组织增生, 并形成较粗的纤维间隔深入肝实质, 大部分形成大小不等的假小叶.第7周模型组与第4周比较肝/体质量比稍增加,胶原纤维面密度略减少, 肝组织病理变化略减轻, 但仍维持肝硬化的特点.

肝纤维化形成的中心通路是肝细胞损伤、坏死, 刺激和激活KC,是启动纤维化的重要因素.KC参与肝纤维化的形成, 主要通过释放转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子, 作用于HSC使其增殖和合成细胞外基质.HSC转化为成纤维样细胞或肌纤维细胞后表达α-SMA.正常肝组织中有两种KC, 第一种是小的、ED1阳性而ED2阴性的细胞, 主要位于门脉血管和中央静脉周围; 第二种是大的、ED1和ED2均阳性, 沿着血窦分布的细胞称为肝组织巨噬细胞[5].单克隆抗体ED1可识别全部单核巨噬细胞系统的细胞, 包括几乎全部肝KC.Orfila et al[6]用CCl4诱发大鼠肝纤维化, 9 wk后ED1阳性细胞明显增加, 主要位于纤维间隔；Bhunchet et al[7]用猪血清诱发大鼠肝纤维化, ED1阳性细胞在新、旧纤维间隔和肝被膜纤维变性部位显著聚集；Hori et al[8]用硫代乙酰胺诱发大鼠肝纤维化, 6 wk后ED1阳性细胞数量明显增加, 位于纤维间隔部位.Baba et al[9]用猪血清诱发3种不同种系大鼠(BN、SD及Wistar)肝纤维化, 8 wk后3种大鼠都形成很多小的假小叶, 免疫组化染色表明CD3、ED1及α-SMA阳性细胞数量增加.Jeong et al[10]用CCl4诱发大鼠肝纤维化, 免疫组化染色发现肝纤维化发展时肝巨噬细胞和肌纤维母细胞的数量增加, 而发生肝硬化后减少.最近国内应用巨噬细胞标志物CD68, 采用免疫组化SP法观察肝癌及肝硬化组织中巨噬细胞的数量和分布的报道[11-12].范建高 et al[13]采用免疫组化二步法观察了大鼠非酒精性脂肪性肝炎组织中的KC, 结果模型组KC数显著增加, 但利用DMN制备肝纤维化动物模型观察肝KC和HSC的研究尚未见报道.本组结果表明模型组第4、7周KC和HSC分布的部位相同, 均在增生的纤维组织及纤维间隔弥漫分布, 与国外报道的其他肝纤维化模型中的分布相似, 表明在DMN诱发大鼠肝纤维化的发生中KC与HSC关系密切, 深入研究KC在肝纤维化发生、发展中的作用机制, 明确其在肝纤维化中的作用才有可能解决肝纤维化的治疗问题, 与KC有关的抗肝纤维化的治疗已有研究报道[14], 最近Imamura et al[15]认为阻断巨噬细胞浸润, 抑制HSC激活, 可制止肝纤维化的发生.

编辑: 王谨辉 审读: 张海宁

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