1缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对新生血管形成的抑制作用

摘要

目的: 研究缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对肿瘤血管形成的影响.

方法: 通过将腺病毒包装的反义HIF-1α(Ad-antiHIF-1α)和腺病毒包装的lacZ标志基因(Ad-lacZ)注射入人大肠癌鸡胚移植模型的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)中, 观察他们对鸡胚移植瘤新生血管形成的影响.

结果: 注射Ad-antiHIF-1α组血管稀疏、纤细, 一级血管数(16.8±1.6 vs 45.2±2.8, t = 2.42, P = 0.02<0.05)及二级血管数(34.8±3.6 vs 58.4±5.3, t = 2.97, P = 0.005<0.01)均明显少于注射Ad-lacZ组.

结论: Ad-antiHIF-1α能有效抑制鸡胚移植瘤新生血管的形成.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 8, 2005
Revised: May 15, 2005
Accepted: May 25, 2005
Published online: August 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

恶性肿瘤从单一细胞生长成为实体肿瘤的过程中, 肿瘤微环境内的氧张力逐渐下降, 处于缺氧状态下的肿瘤细胞仍能不断增殖、浸润, 主要依赖于两方面的调节: 首先是肿瘤血管生成: 肿瘤生长直径超过几毫米, 就必须生成血管, 而VEGF在肿瘤血管生成调控方面起着重要作用; 其次, 肿瘤细胞在缺氧状态下通过增加糖酵解酶活性, 加速糖酵解来获得能量[1-5].研究表明, VEGF基因和糖酵解过程中多种关键酶基因都是受HIF-1α调控的, HIF-1α通过促进肿瘤组织的血管生成和能量代谢加速肿瘤组织的生长[6-10].我们通过设计HIF-1α的反义寡核苷酸, 研究他对鸡胚移植瘤的生长及诱发血管生成反应的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

含目的基因重组腺病毒的包装: 含反义HIF-1α重组腺病毒由第一军医大学实验中心提供, 鉴定正确的重组腺病毒大量扩增后, 经221 250 g超速离心18 h、纯化浓缩, 透析去除CsCl, 然后测定病毒浓度, 最后加同等体积的2倍浓度储存缓冲液于-70℃以下储存备用.大肠癌LOVO细胞由第一军医大学消化实验室传代培养.白皮受精鸡卵购买自北京农大种鸡厂, 每蛋52-64 g.

1.2 方法

参考付生法[11]的方法制备CAM模型, 并加以改进, 新鲜受精鸡卵以1%新洁尔灭清洗后放入37℃, 60% 相对湿度的孵箱内孵育, 每天翻蛋2次.孵育至7 d在照蛋器指示下距胚头右下方1.5 cm处做标记, 用碘酒、酒精消毒后, 以标记处为中心开出1 cm×1 cm的小窗, 滴加2滴生理盐水使鸡胚绒毛尿囊膜下塌, 与卵壳膜分离, 去除卵壳膜, 暴露鸡胚绒毛尿囊膜, 制成假气室, 用无菌贴膜封口, 窗口朝上继续孵育, 不再翻蛋.癌细胞接种方法: 收集指数生长期的癌细胞, 用RPMI1640培养液作为稀释液将其浓度调整至6×10¹⁰/L, 吹打均匀后, 用微量加样器准确吸取0.1 mL的细胞悬液, 接种至CAM相对无血管区, 立即用无菌透明胶带封闭, 放入孵化箱中继续孵育.上述操作均在无菌超净台上进行.将接种后鸡胚随机分为2组, 每组10个, 注射Ad-反义HIF-1α组为实验组, 注射Ad-lacZ 的鸡胚为对照组.于接种癌细胞后第2 d, 揭开贴膜, 用1 mL一次性注射器将预先制备的重组腺病毒0.2 mL注射入癌细胞接种区周围的绒毛尿囊膜中, 然后以贴膜覆盖后继续孵育5 d, 揭去贴膜, 向假气室内加入等量甲醇、丙酮配成的固定液, 固定15 min, 剪下鸡胚绒毛尿囊膜, 平铺于滤纸上, 在肉眼及显微镜下观察鸡胚血管生长情况, 并用近摄相机摄影, 在显微镜下记数移植瘤边缘血管数, 以移植瘤边缘1 mm为一级血管, 移植瘤边缘5 mm为二级血管分别记数.

统计学处理 所有数据均用mean±SD表示, 采用SAS统计软件对组间数据进行t检验.

2 结果

2.1 肉眼观察

注射Ad-反义HIF-1α组鸡胚绒毛尿囊膜中的血管稀疏、纤细, 血管分支及新生血管形成较少, 移植瘤周围放射状走行的微血管极不明显(图1A); 注射Ad-lacZ组从癌细胞接种后3 d开始, 鸡胚绒毛尿囊膜中的血管密度增加, 血管分支及新生血管形成较多, 大量宿主血管呈放射状向瘤体集中, 形成血管辐聚现象, 移植瘤周围放射状走行的微血管非常明显(图1B).

图1 注射药物后的鸡胚绒毛尿囊膜. A: Ad-反义HIF-1α; B: Ad-lacZ.

2.2 微血管记数

注射Ad-反义HIF-1α组一级血管数及二级血管数均明显少于注射Ad-lacZ组(表1).

表1 注射Ad-反义HIF-1α及Ad-lacZ对CAM血管生成的影响(mean±SD).

分组	一级血管数(条)	二级血管数(条)
Ad-反义HIF-1α组	16.8±1.6a	34.8±3.6b
Ad-lacZ组	45.2±2.8	58.4±5.3

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs Ad-lacZ组.

3 讨论

应用反义寡核苷酸封闭基因表达是基因治疗肿瘤的重要方法之一, 反义技术的关键是选择合适的靶基因, 最理想的靶点是肿瘤细胞生长所必需, 而又不存在于正常细胞的成分.HIF-1是调节细胞内氧代谢的关键因子, 对HIF-1α的体内功能研究发现, HIF-1α是血管生长信号途径的关键上游转录因子.在含氧量正常的条件下, HIF-1α被羟基化, 而与泛肽链接酶复合物的成分Ｖ蛋白相结合, 最终导致HIF-1α的泛肽化而降解.在缺氧条件下, HIF-1α的羟基化被抑制从而被激活, 进一步与缺氧反应元件中的增强子结合, 激活相应缺氧反应基因的转录和表达, 这些缺氧反应基因包括众多血管生成因子基因.一旦新的血管生成, 他们会把至关重要的氧输送给肿瘤, 甚至允许癌细胞进入血液并转移至其他组织, 这个过程就是肿瘤的转移.由此分析, 选择HIF-1作为肿瘤治疗的靶点显然比以单一或数个血管生长因子为靶点更有价值[12-13].

鸡胚移植模型是研究肿瘤生物学特性特别是肿瘤诱导血管生成的良好模型.本研究结果显示, 在CAM移植瘤模型中, 注射Ad-lacZ组鸡胚绒毛尿囊膜中的血管新生符合肿瘤血管的特点, 接种区血管密度增加, 血管分支及新生血管形成较多, 移植瘤周围放射状走行的微血管非常明显.而注射Ad-反义HIF-1α组鸡胚绒毛尿囊膜中的血管稀疏、纤细, 血管分支及新生血管形成较少, 移植瘤周围放射状走行的微血管极不明显.说明反义HIF-1α基因对鸡胚移植肿瘤的血管新生有明显抑制作用.其作用机制可能是通过抑制VEGF基因的表达, 减少VEGF的合成, 从而使VEGF对肿瘤血管生成的特异性作用受到抑制, 同时, 可以通过抑制糖酵解过程中多种相关酶基因的活性, 抑制肿瘤细胞代谢, 从而达到抑制肿瘤生长的目的[14-15].

备注

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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