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世界华人消化杂志. 2005-08-15; 13(15): 1842-1845
在线出版日期: 2005-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i15.1842
CD1小鼠胃肠道快速延迟性整流性钾通道基因的分布
余英, 余保平, 汪福群
余英, 余保平, 汪福群, 武汉大学人民医院消化内科 湖北省武汉市 430060
余英, 女, 1980-08-27生, 湖北省武汉市人, 汉族, 2003年武汉大学硕士生, 主要从事胃肠动力学的基础研究.
通讯作者: 余保平, 430060, 湖北省武汉市, 武汉大学人民医院消化内科. yubaoping62@yahoo.com.cn
电话: 027-68759391
收稿日期: 2005-06-06
修回日期: 2005-06-10
接受日期: 2005-06-13
在线出版日期: 2005-08-15

目的: 研究快速延迟性整流性钾通道基因(ether-a-go-go-related gene, ERG)mRNA及相关蛋白在正常小鼠胃肠道的表达及不同部位分布的差异性.

方法: 用原位杂交、RT-PCR和免疫组化技术检测CD 1小鼠胃、空肠、回肠和结肠组织ERGmRNA及相关蛋白的分布.

结果: 三种方法显示胃、空肠、回肠和结肠组织均有ERG阳性表达, 阳性细胞主要分布在肌层, 少量分布在黏膜、浆膜. 胃和结肠ERG阳性表达明显高于回肠和空肠, 具有显著性差异(4.30±0.95, 3.60±0.70 vs 2.70±0.82, 2.30±1.06;P<0.05).

结论: ERG在CD1小鼠胃肠道有阳性表达, 并在胃肠道不同部位的表达存在差异性.

关键词: 快速延迟性整流性钾通道基因; 原位杂交; 免疫组化; 逆转录聚合酶链反应; 胃肠道; 小鼠
引文著录: 余英, 余保平, 汪福群. CD1小鼠胃肠道快速延迟性整流性钾通道基因的分布. 世界华人消化杂志 2005; 13(15): 1842-1845
Expression of ether-a-go-go-related gene in gastrointestinal tract of normal CD1 mice
Ying Yu, Bao-Ping Yu, Fu-Qun Wang
Ying Yu, Bao-Ping Yu, Fu-Qun Wang, Department of Gastroenterology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Correspondence to: Dr. Bao-Ping Yu, Department of Gastroenterology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China. yubaoping62@yahoo.com.cn
Received: June 6, 2005
Revised: June 10, 2005
Accepted: June 13, 2005
Published online: August 15, 2005

AIM: To investigate the expression of ether-a-go-go-related gene (ERG) mRNA and protein and its different distributions in the gastrointestinal tract of CD1 mice.

METHODS: The expression of ERG K+ current related protein was examined by immunohistochemistry and the expression of ERG mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ hybridization in the tissues of stomach, jejunum, ileum and colon from adult CD1 mice. Then the distribution of ERG was analyzed.

RESULTS: ERG was positively expressed in all the tissues of stomach, jejunum, ileum and colon. The positive cells mainly distributed in the muscular layer. A small number of positive cells distributed in the mucosa and chorion. The levels of ERG expression in stomach and colon were significantly higher than those in jejunum and ileum (4.30±0.95, 3.60±0.70 vs2.70±0.82, 2.30±1.06; P<0.05).

CONCLUSION: ERG is expressed in the gastrointestinal tract of CD1 mice. Furthermore, the expression is differential at different sites.

Key Words: Ether-a-go-go-related gene; In situ hybridization; Immunohistochemistry; Reverse transcription polymerase chain reaction; Gastrointestinal tract; Mice
0 引言

ERG(Ether-a-go-go-related gene)编码快速延迟性整流性钾通道的a亚基, 该亚基参与构成快速延迟性整流性钾通道的电压感知功能区. 该通道在心脏起搏细胞电流频率的调节及维持心肌细胞静息电位的稳定性中起着重要作用[1-2], HERG(human-ether-a-go-go-related gene)突变常导致长QT间期综合征[3-6].ERG最初被认为只在心脏表达, 随着研究的深入, 人们发现他也存在于其他许多组织中(如脑神经细胞), 并在不同组织中扮演着重要角色. 目前有研究发现食管中也有ERG的表达, 但在胃肠道的表达罕有报道. 我们首次用原位杂交技术来研究ERG在胃肠道中的存在性, 并结合RT-PCR和免疫组化技术首次探讨ERG在胃肠道不同部位的分布情况.

1 材料和方法
1.1 材料

成年CD-1小鼠10只, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 雌雄不限, 自由饮食饮水, 室温保持在(24±2) ℃, 12 h昼夜交替. rabbit anti-mouce human erg polyantibody(Santa Cruz公司), ERG原位杂交试剂盒(博士德公司), 羊抗兔IgG(中山公司), Trizol试剂(美国Invitrogen公司), dNTP Mix, Rnasin(Takara公司), M-MLV逆转录酶及缓冲系统(Promega公司), Taq DNA聚合酶及缓冲系统(Biostar公司), ERG上下游引物、β-actin上下游引物由上海生工合成.

1.2 方法

禁食12 h后颈椎脱臼法处死, 取出胃, 空肠(幽门后2 cm), 回肠(回盲瓣前5 cm), 结肠(盲肠后2 cm), 在装有Kreb营养液的烧杯中去除胃肠内容物. (Kreb营养液成分如下:NaCl 120.6 mmol/L, KCl 5.9 mmol/L, CaCl2 22.5 mmol/L, NaHCO315.4 mmol/L, NaH2PO4 1.2 mmol/L, C6H12O6 11.5 mmol/L, pH = 7.4).

1.2.1 ERGmRNA原位杂交: 原位杂交试剂盒采用针对ERG的寡核苷酸探针, 经地高辛标记. 针对小鼠ERG靶基因的mRNA序列为: (1)5'-GACAC CATCA TCCGC AAGTT TGAGG GCCAG AGCCG-3'(2)5'-CATGA CACCA ACCAC AGGGG CCCCT CTACC AGCTG-3'(3)5'-AACAG GCTGG AAACC CGGCT AAGTG CAGAC ATGGC-3'.原位杂交实验步骤严格按照试剂盒说明书操作进行. 阳性信号以胞质及少量胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒判断.

1.2.2 RT-PCR分析: 按Trizol RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA, RNA保存在-70 ℃, 用紫外分光光度吸收法在260 nm处测定RNA的含量. 引物如下:ERG上游引物:5'-TCTCCATCTGTGTCATGCTC-3', ERG下游引物:5'-ACCAAGCATGCTGGAAGTAC-3'.β-actin上游引物:5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3', β-actin下游引物:5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'.然后进行逆转录和PCR扩增反应.

1.2.3 免疫组化评分: 免疫组化SABC法染色步骤严格按试剂说明书进行, 阳性对照片为心脏组织, 以PBS代替一抗做阴性对照. 阳性信号以胞质及少量胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒判断. 免疫组化评分(immunohi-stochemical scores IHS)方法见参照[7]文献, 结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分:a为阳性细胞百分比(无阳性细胞 = 0, 阳性细胞占1-10% = 1, 11-50% = 2, 51-80% = 3, 81-100% = 4), b为阳性细胞染色强弱(阴性 = 0, 弱阳性 = 1, 中度阳性 = 2, 强阳性 = 3), a, b两项乘积即为该例组织的IHS.

统计学处理 数据以mean±SD表示. 各组ERG的IHS的变化值运用统计软件SPSS12.0作单因素方差分析, 组间比较采用SNK(q检验), 以P<0.05为有统计学差异.

2 结果
2.1 ERGmRNA原位杂交

胃、空肠、回肠、结肠均有阳性表达(细胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性). 着色主要在环肌层和纵肌层, 黏膜腺体、浆膜有少量着色(图1).

图1
图1 小鼠胃肠道ERGmRNA阳性染色(×400). A: 胃肌层; B: 空肠肌层; C: 回肠肌层; D: 结肠肌层.
2.2 RT-PCR

成年CD1小鼠(n = 10)胃体、空肠、回肠、结肠平滑肌中均表达ERGmRNA. 所检测到的ERGcDNA片段大小为198 bp, 位于全系列(NM_013569)的2252-2449间. 用同一只小鼠心肌组织作为阳性对照(图2).

图2
图2 PT-PCR结果. 1: Maker; 2: β-actin; 3: 心脏(阳性对照); 4: 胃体; 5: 空肠; 6: 回肠; 7: 结肠.
2.3 ERG免疫组化

胃、空肠、回肠、结肠均有阳性表达(细胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性), 着色主要在环肌层和纵肌层, 黏膜腺体及浆膜有少量着色. 胃, 结肠ERG明显高于空肠和回肠(图3). 染色结果用免疫组化评分(IHS)表示, 结果: 胃4.30±0.95分, 空肠2.70±0.82分, 回肠2.30±1.06分, 结肠3.60±0.70分. 各组ERG的IHS的变化值作单因素方差分析, 得出P<0.01有统计学意义. 证明至少有两组表达差异有统计学意义. 不同部位的ERG的IHS两两比较采用SNK(q检验), 得出胃、结肠IHS明显高于空肠、回肠(P<0.05)有统计学意义. 胃与结肠比较无显著性差异(P>0.05), 空肠与回肠比较无显著性差异(P>0.05).

图3
图3 免疫组化染色阳性(×400). A: 胃肌层; B: 空肠肌层; C: 回肠肌层; D: 结肠肌层.
3 讨论

ERG基因是一种延迟整流性钾通道基因, 属电压门控性钾通道家族, 而后研究表明其在心脏表达最为强烈. 深入研究发现在大鼠脑小胶质细胞[8]、大鼠脑垂体[9]、大鼠颈动脉窦化学感受器细胞[10]、大鼠肺小动脉平滑肌细胞[11]、人胰腺b细胞[12]、小鼠门静脉[13]也都存在ERG通道基因. 但在消化道罕有类似报道, 1999年Akbarali et al[14]在负鼠食管平滑肌细胞中发现ERG阳性表达. 本实验补充说明ERG在胃、空肠、回肠、结肠也有表达, 证明ERG在整个消化道广泛分布. 其次本实验用原位杂交检测ERG, 不仅从基因水平证明ERG的存在, 而且初步定位ERG存在于胃肠道平滑肌细胞. 另外我们首次证明了ERG在胃, 空肠, 回肠, 结肠的表达存在不均一性, 在胃、结肠的表达量明显高于空肠、回肠; 胃和结肠之间, 空肠和回肠之间表达无明显差异性. 我们推测ERG在胃肠道的不均匀分布与胃肠道不同部位平滑肌收缩力及收缩节律差异性相关. 研究表明快速延迟性整流性钾通道参与调节平滑肌舒张和收缩功能, 主要是通过对平滑肌细胞膜钾通道的开放或抑制进行的. 当钾通道开放, 细胞钾离子外流增加, 细胞膜超极化, 一方面通过关闭电压门控钙通道, 使细胞外钙内流减少; 另一方面通过钠和钙交换及三磷酸肌醇途径使细胞内钙释放减少, 导致细胞内游离钙与钙调素结合下降, 肌球蛋白轻链激酶活性降低, 肌动与肌球蛋白相互作用产生的收缩力也减弱, 从而导致平滑肌舒张. 相反, 钾通道活性受抑制时, 则引起平滑肌细胞膜去极化, 从而导致平滑肌收缩[15]. 胃肠道平滑肌快速延迟性整流性钾通道的活性受ERG表达多寡予以调控, 当ERG表达增多时, 该通道数量增多, 其活性增强[16], 从而导致胃肠道平滑肌的收缩力减弱, 平滑肌舒张. 反之, ERG表达减弱时该通道数量减少, 活性减弱, 从而导致胃肠道平滑肌收缩力增强, 平滑肌收缩. 因此胃肠道不同部位ERG的表达多寡不同可能是导致胃肠道各段平滑肌收缩力和收缩节律不同的原因之一. 既往在研究ERG时, 研究动物多采用兔[17], 大鼠[9-11], 犬[18-19], 豚鼠[20], 而我们选用小鼠, 证明了ERG也存在于小鼠, 补充说明了ERG存在的物种多样性.

ERG的表达多寡及活性都会影响到胃肠道平滑肌的收缩和舒张功能, 我们推测先天性或后天病理情况导致的ERG在胃肠道表达和分布的异常或者ERGK+ 通道活性的改变, 都可能导致胃肠道运动的异常. 如今胃肠道动力疾病如功能性消化不良、肠易激综合征和慢性便秘等发病率日益增高, 已成为明显影响人们生活质量的常见病和多发病, 而该类疾病的发生与胃肠道平滑肌收缩力改变密切相关. 因此, 胃肠道动力疾病与ERG改变的相关性值得我们进一步研究. 另外在临床用药上, 某些药物引起胃肠道动力异常是否与ERG发生改变有关也值得我们进一步探讨.

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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