研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-07-28; 13(14): 1776-1778
在线出版日期: 2005-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i14.1776
BALB/C小鼠炎症性肠病动物模型建立方法探讨
刘敬军, 郑长青, 潘丽丽, 闻英, 胡刚正
刘敬军, 郑长青, 潘丽丽, 闻英, 胡刚正, 中国医科大学第二临床学院 辽宁省沈阳市 110001
通讯作者: 刘敬军, 110001, 辽宁省沈阳市和平区北二马路92号, 中国医科大学第二临床学院. shyljj@yahoo.com.cn
电话: 024-23281706 传真: 024-23280417
收稿日期: 2005-05-08
修回日期: 2005-05-22
接受日期: 2005-06-08
在线出版日期: 2005-07-28

目的: 对三硝基苯磺酸(TNBS)、葡聚糖硫酸钠(DSS)及恶唑酮三种外源性化学刺激物建立的BALB/C小鼠炎症性肠病(IBD)模型的特征加以比较探讨, 以筛选合适的克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的动物模型.

方法: 将BALB/C小鼠50只随机平均分成5组, 即恶唑酮组、TNBS组、DSS组、A对照组(500 mL/L乙醇灌肠)、B对照组(自由饮用蒸馏水), 每组小鼠给药后观察并记录每只小鼠一般变化, 实验第8 d处死全部小鼠, 留取结肠标本, 行病理切片检查.

结果: 恶唑酮组、TNBS组、DSS组小鼠给药后均出现IBD的一般表现, 恶唑酮组、TNBS组及DSS组小鼠DAI计分分别较A对照组及B对照组有统计学差异(P<0.05). 恶唑酮组、DSS组小鼠病理改变类似人UC病理改变, 病理计分较A、B对照组有统计学差异(P<0.05);TNBS组小鼠病理改变类似人CD病理改变, 病理计分较A对照组有统计学差异(P<0.05).

结论: BALB/C小鼠恶唑酮致敏后灌肠及自由饮用DSS能够诱导出较理想的病理改变类似于人UC的动物模型;TNBS灌肠能够诱导出较理想的病理改变类似于人CD的动物模型.

关键词: N/A

引文著录: 刘敬军, 郑长青, 潘丽丽, 闻英, 胡刚正. BALB/C小鼠炎症性肠病动物模型建立方法探讨. 世界华人消化杂志 2005; 13(14): 1776-1778
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: May 8, 2005
Revised: May 22, 2005
Accepted: June 8, 2005
Published online: July 28, 2005

N/A

Key Words: N/A


0 引言

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种慢性非特异性胃肠道炎症性疾病, 包括克罗恩病(Crohn disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC). 本病呈世界性分布, 也是严重危害我国人民健康的疾病, 且近年来其发病率呈逐年上升趋势. IBD病因至今不明, 发病中有免疫因素[1-3]和各种炎症递质的参与. 目前临床以水杨酸制剂、皮质激素和免疫抑制剂等药物治疗为主, 但疗效不够满意, 且长期应用有较多副作用, 因此建立理想的动物模型对阐明该病的病因、发病机制及观察药物疗效有重要意义. 由于IBD的病因、发病机制复杂, 所以很难建立理想的动物模型. 通过外源性化学刺激物诱导鼠肠道黏膜产生免疫反应来建立IBD动物模型是一种常用的方法. 本研究应用最为常见的三硝基苯磺酸(2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)、葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)、恶唑酮(oxazolone)三种外源性化学刺激物分别建立BALB/C小鼠IBD模型, 以期对该方法做一较为全面的探讨, 以筛选合适的CD和UC的动物模型.

1 材料和方法
1.1 材料

动物选用6-8 wk SPF级BALB/C♀小鼠, 体质量约20-25 g, 由中国医科大学附属第二临床学院动物实验中心提供. 恶唑酮、TNBS、DSS(Mr 5 000)均由Sigma公司提供.

1.2 方法

取50只小鼠随机分为5组, 分别为恶唑酮组、TNBS组、DSS组、A对照组、B对照组, 每组10只. 实验前5 d 30 g/L恶唑酮无水乙醇溶液0.15 mL涂抹恶唑酮组小鼠腹部皮肤暴露部位, 范围2 cm×2 cm. 实验前24 h, 恶唑酮组、TNBS组、A对照组小鼠禁食(不禁水), 先用50 g/L水合氯醛0.15 mL腹腔注射使小鼠轻度麻醉, 约25 min以后用套接了小号导尿管的1 mL注射器抽吸药液, 从肛门将导尿管缓慢插入约3.5 cm, 然后将药液缓慢注入, 停20 s后抽出导尿管, 再将小鼠倒悬约30 s后放入盒中. 恶唑酮组灌注10 g/L恶唑酮

500 mL/L乙醇溶液0.15 mL, TNBS组灌注20 g/L TNBS 500 mL/L乙醇溶液0.1 mL, A对照组灌注500 mL/L乙醇溶液0.15 mL.DSS组、B对照组小鼠实验当天早晨开始自由饮液, DSS组小鼠饮用液体为5 g/L DSS蒸馏水溶液, B对照组小鼠饮用液体为蒸馏水, 连续7 d. 实验第8 d处死全部小鼠, 大体观察肠壁, 分离结肠, 沿肠系膜缘剪开肠腔, 生理盐水冲洗粪便, 留取结肠标本, 40 g/L甲醛固定, 行病理切片, 苏木精-伊红染色检查. 观察指标为疾病活动指数(DAI)、病理组织学计分, 评分标准见表1[4], 表2[5].

表1 DAI评分标准.
体质量下降(%)大便性状便血计分
正常隐血(-)0
1-5松散隐血(+)1
5-102
10-15稀便肉眼血便3
>154
表2 病理组织学计分标准.
上皮损伤和溃疡形成溃疡深度水肿淋巴, 单核, 浆细胞浸润浸润深度中性粒细胞浸润浸润深度嗜酸性粒细胞浸润浸润深度计分
0
糜烂黏膜下层轻度轻度黏膜下层轻度黏膜下层轻度黏膜下层1
溃疡肌层中度中度肌层中度肌层中度肌层2
浆膜层重度重度浆膜层重度浆膜层重度浆膜层3

统计学处理 所有计算均用SPSS 10.0统计软件来完成, 数据用mean±SD表述, 各组数据之间的比较采用t检验.

2 结果
2.1 一般情况

恶唑酮组、TNBS组、DSS组小鼠分别于第2、3 d开始全部出现稀便及明显体质量下降, 其中恶唑酮组4只小鼠出现血便, 4只小鼠便潜血阳性;TNBS组7只小鼠出现血便, 3只小鼠便潜血阳性;DSS组3只小鼠出现血便, 5只小鼠便潜血阳性. A对照组小鼠第1 d便开始出现松散便或稀便, 但第7 d大便已基本正常, 其中5只小鼠体质量稍下降. B对照组小鼠仅有2只出现体质量稍下降. 各组小鼠DAI评分见表3.

表3 各组小鼠DAI评分(mean±SD).
组别nDAI计分
恶唑酮组108.60±1.26a
TNBS组109.10±1.52a
DSS组108.20±1.32c
A对照组102.70±1.83
B对照组100.20±0.42
2.2 大体形态

恶唑酮组、DSS组小鼠黏膜病变从肛门侧自下向上连续性发展, 逐渐减轻, 直肠最为严重, 近端结肠几乎正常, 病变部黏膜呈中、重度充血水肿, 散在糜烂、浅溃疡. TNBS组小鼠病变以结肠末端为主, 但可达近端结肠, 2只小鼠病变达末端小肠, 病变部黏膜呈充血水肿, 糜烂、坏死, 多发溃疡, 溃疡深大, 坏死严重, 肠腔狭窄. A、B对照组小鼠结肠黏膜基本正常.

2.3 光镜下病理形态

恶唑酮组、DSS组小鼠黏膜均见中、重度充血水肿, 浅溃疡, 仅1例恶唑酮组小鼠溃疡达肌层, 恶唑酮组小鼠黏膜、黏膜下层以淋巴细胞浸润为主, 而DSS组小鼠黏膜、黏膜下层以中性粒细胞浸润为主. TNBS组小鼠黏膜充血水肿, 上皮脱落、坏死, 溃疡形成, 部分溃疡达浆膜层, 黏膜、黏膜下层以中性粒细胞浸润为主. A对照组4例出现黏膜、黏膜下层轻度细胞浸润. B对照组仅2例小鼠出现黏膜、黏膜下层轻度细胞侵浸润. 各组小鼠病理计分见表4.

表4 各组小鼠病理计分(mean±SD).
组别n病理计分
恶唑酮组1013.20±1.69a
TNBS组1014.00±1.15a
DSS组1012.30±1.64c
A对照组101.00±1.33
B对照组100.60±0.97
3 讨论

IBD的许多研究成果来源于IBD动物模型, 因而构建合适的IBD动物模型对IBD的研究非常重要. 目前, 建立IBD动物模型的方法主要有4种: 第1种是某些动物可自然发生肠道黏膜炎症, 此类模型的存在提示炎症性肠病的发生可能与某些基因特征有关[3-4];第2种是通过基因敲除及转基因技术诱导的模型, 此模型可从基因水平阐明肠道炎症的免疫发病机制; 第3种是用异体结肠黏膜等作为抗原刺激造成慢性免疫性炎症; 第4种是通过外源性化学刺激物而诱发的模型, 其中第4种方式应用的较为普遍, 而近年来应用较多的用来诱导IBD动物模型的化学刺激物是恶唑酮、TNBS及DSS.

恶唑酮是一种半抗原, 应用其诱导IBD动物模型时, 通过皮肤先致敏再灌肠给药, 较直接灌肠给药能更好地模拟出IBD动物模型, 本实验即先予30 g/L恶唑酮无水乙醇溶液0.15 mL涂抹小鼠皮肤暴露部位, 再予10 g/L恶唑酮500 mL/L乙醇溶液0.15 mL灌肠, 小鼠第2 d迅速发病, 临床及病理表现均与UC相似.

DSS是由蔗糖合成的一种硫酸多糖体, 具有和肝素一样的抗止血和抗凝血作用, 其诱导的动物模型被广泛应用于实验性IBD研究. 本实验应用50 g/L DSS蒸馏水溶液, 给小鼠自由饮用, 连续7 d, 出现远端结肠急性炎症表现, 病理及临床表现与UC相似, 说明DSS诱导的动物模型适合UC的研究.

TNBS诱导的IBD动物模型具有CD的特点, 本实验TNBS组小鼠结肠病理可见黏膜充血水肿, 糜烂、坏死, 多发溃疡, 溃疡深大, 部分溃疡达浆膜层, 坏死严重, 肠腔狭窄, 病变可达小肠末端.

恶唑酮、DSS及TNBS诱导IBD动物模型的机制未完全阐明. 大量证据显示Th1细胞和Th2细胞的平衡失调可能与IBD的发病相关[6-9].Th1细胞主要分泌干扰素-g(IFN-g)、白介素-2(IL-2);Th2细胞主要分泌白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5).Th1细胞、Th2细胞通过分泌细胞因子相互调节对方的生长分化, 从而维持Th1细胞、Th2细胞之间的平衡, 这一平衡的破坏与IBD的发病密切相关. 已有研究[10-14]表明恶唑酮诱导的结肠炎IL-4升高, IFN-g下降, 主要由Th2细胞所介导, TNBS诱导的结肠炎IL-4下降, IFN-g升高, 主要由Th1细胞所介导, 而DSS诱导的结肠炎IL-4、INF-g均升高为非典型Th1细胞和Th2细胞反应.

编辑:王谨晖 审读:张海宁

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