巢式PCR-RFLP法对湖南省乙型肝炎病毒Bj和Ba基因亚型的初步鉴定

摘要

目的: 检测湖南省乙型肝炎病毒(HBV)基因亚型(Bj或Ba)的分布情况, 了解基因亚型与HBV致病性的关系, 希望以此诠释相同基因型HBV导致不同病情的机制.

方法: 随机选取经多对型特异性引物巢式PCR法鉴定为B基因型HBV的血清标本50例, 包括慢性HBV携带者和慢性重型乙型肝炎患者各25例, 采用巢式PCR-RFLP法鉴定其基因亚型(Bj或Ba).

结果: 50例B基因型HBV均为Ba亚型, 没有发现Bj亚型.

结论: 湖南省B基因型HBV可能主要为Ba亚型. 相同基因型HBV导致不同病情的机制可能还与其他因素(如HBV准种)有关.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 23, 2005
Revised: May 30, 2005
Accepted: June 8, 2005
Published online: July 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

已有研究表明, 东亚地区乙型肝炎病毒(HBV)的基因型以B型和C型为主[1], 且C型HBV的致病力强于B型HBV[2-11]. 虽然HBV基因型能在一定程度上解释乙型肝炎的病情程度、预后和转归, 但我们也很容易发现, 相同基因型的HBV可引起不同的临床表现. 日本和中国都有B型HBV, 但日本B型HBV所致肝炎的症状一般都轻于中国B型HBV. 台湾Kao et al[12]发现B型的年轻患者更易发展成肝癌, 而日本Orito et al[13]的研究结果却恰恰相反. 这种相同HBV基因型患者出现不同病情, 而不同HBV基因型患者却可出现相同病情的现象, 究竟是何原因引起, 除了患者个体差异外, 是否还有HBV基因亚型等因素的影响? 这是一个困扰HBV基因型研究者们的难题.

2002年, 日本学者Sugauchi et al[14]测定了70例B型HBV的基因组全序列, 根据前-C区/C区与C型HBV有无重组序列将B型HBV分为Ba和Bj两种亚型. 2003年他发现在1 838位点处所有Ba亚型均为A碱基, 而所有Bj亚型为G碱基, 于是利用这点研制出一种快速简便区分两种亚型的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法, 即在鉴定Bj亚型时将引物3'端的第4位碱基C改为A, PCR扩增后即可得到SpeI序列(ACTAGT), 经SpeI酶切后如能产生89 bp大小片段即可鉴定为Bj亚型HBV感染; 同样将引物3'端的第3位碱基C改为T, PCR扩增后即可得到MseI序列(TTAA), 经MseI酶切后如能产生89 bp大小片段即可鉴定为Ba亚型HBV感染. 他用此法检测了274例东亚各地区的B型HBV感染者, 发现中国等地主要为Ba亚型, 而日本为Bj亚型, 且Ba亚型患者的HBeAg阳性率和核心启动子双位点(T1762/A1764)突变率显著高于Bj亚型, 在一定程度上解答了上述问题[15].

但是, 在以B基因型为主的中国湖南省[16-17], 到底以哪种基因亚型为主, 是否也可从HBV基因亚型角度解释湖南省慢性乙型病毒性肝炎病情多样化、复杂化的现象, 这些都不得而知. 为此本文准备从此入手, 采用Sugauchi的PCR-RFLP法检测湖南省HBV基因亚型的分布情况, 以期进一步了解HBV基因亚型与HBV致病性的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

血清DNA抽提试剂盒(上海申友生物公司);dNTP、PCR缓冲液、超纯型Taq Plus Polymerase、Marker(DGL2000)为北京鼎国公司产品; 琼脂糖(西班牙进口, 上海博亚生物公司分装); 限制型内切酶SpeI和MseI分别为日本TaKaRa公司和美国MBI公司产品;DNA循环扩增仪(486型, 美国 PE公司), 紫外透光仪(日本ATTO公司产品); 高速冷冻离心机(美国Beckman公司产品, 型号GS-15R); 稳压稳流电泳仪(上海Tanon公司产品, 型号EPS-300);GIS凝胶电脑全自动图像处理仪(上海Tanon公司产品, 型号为UV-2000). 试验所用血清标本采自2002-06/2003-03中南大学湘雅医院感染病科门诊和住院部的湖南籍慢性乙型肝炎患者, 经感染病科临床PCR实验室荧光实时定量PCR鉴定HBV-DNA为阳性, 并经多对型特异性引物巢式PCR法[17]鉴定为B基因型. 选取其中50例作为研究对象, 包括慢性HBV携带者和慢性重型乙型肝炎患者各25例, 其中男36例, 女14例, 年龄为12-58岁.

1.2 方法

1.2.1 引物设计: 参照文献[15]设计了BJHBF、BAHBF、HBAS-4V、BJA-RV四条用于巢式PCR扩增的内外引物, 由日本TaKaRa公司合成(表1).

表1 PCR-RFLP方法鉴定Bj和Ba基因亚型所用引物.

引物名称	引物序列	位点	特性	方向
BJHBF	5'-ATG CAA CTT TTT CAC CTC TGA CTA-3'	nt1 814-1 837	Bj	正义
BAHBF	5'-ATG CAA CTT TTT CAC CTC TGC TTA-3'	nt1 814-1 837	Ba	正义
HBAS-4V	5'-ATA GGG GCA TTT GGT GGT TCT-3'	nt2 316-2 297	无	反义
BJA-RV	5'-TTC TTT ATA CGG GTC AAT GTC CAT G-3'	nt1 924-1 901	无	反义

BJHBF和BAHBF序列中斜体部分为修改后碱基, 目的是产生SpeI和MseI的酶切位点.

1.2.2 血清DNA提取: 按照试剂盒说明书中浓缩裂解法进行, 略改动. 简述如下: 取50 mL浓缩液到0.5 mL离心管中, 再加入待测血清标本50 mL, 振荡混匀后静置2 min, 8 000 g离心5 min, 弃上清. 加入10 mL裂解液, 剧烈振荡至无沉淀后短暂离心, 沸水浴10 min, 14 000 g离心15 min, 取上清液2 mL为模板做PCR反应.

1.2.3 巢式PCR: 所有血清标本提出HBV-DNA后, 均分别按照Bj和Ba检测方法进行检测. (1)Bj亚型的检测: 首先用引物BJHBF和HBAS-4V作为一对外引物进行第一轮PCR扩增, PCR反应体系如下:BJHBF(50 mmol/L)1 mL, HBAS-4V(50 mmol/L)1mL, dNTP(10 mmol/L)1 mL, Taq聚合酶(2×10⁶/L)1 mL, 10×PCR缓冲液5 mL, MgCl₂(20 mmol/L)5 mL, 模板2 mL, 灭菌DDW 34 mL, 总体积50 mL. 混合后直接置于DNA循环扩增仪进行反应, 条件为95 ℃预变性5 min, 按94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min扩增35个循环, 再72 ℃延伸7 min. 然后以PCR扩增产物为模板, 以引物BJHBF和BJA-RV作为一对内引物进行第二轮PCR扩增, 反应体系同第一轮, 反应条件为95 ℃预变性5 min, 按94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s扩增32个循环, 再72 ℃延伸7 min. 将巢式PCR扩增产物置于15 g/L琼脂糖凝胶中, 90 V稳压电泳10 min后, 于紫外灯下观察是否有110 bp大小的条带. (2)Ba亚型的检测: 以BAHBF和HBAS-4V为外引物, 以BAHBF和BJA-RV为内引物进行巢式PCR, 方法同Bj亚型的检测.

1.2.4 限制性片段长度多态性(RFLP): (1)Bj亚型的检测: 采用内切酶SpeI(107 U/L)进行酶切, 反应体系如下:PCR 产物10mL, 10×buffer 2 mL, SpeI(107 U/L)1 mL, DDW 7 mL, 共20 mL. 混合均匀后置于37 ℃中水浴3 h, 然后于30 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳, 如110 bp大小的PCR产物被切成89 bp大小片段, 则为Bj亚型. (2)Ba亚型的检测: 采用内切酶MseI进行酶切, 反应体系和反应条件同上. 然后于30 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳, 如110 bp大小的PCR 产物被切成89 bp大小片段, 则为Ba亚型.

2 结果

2.1 巢式PCR-RFLP法鉴定Bj和Ba亚型结果

通过巢式PCR扩增出110 bp大小的片段, 再经RFLP法进行酶切, 可清楚辨别出Bj和Ba亚型(图1-2). 该方法操作简便, 且由于人为地加入一个碱基产生特异性酶切位点, 从而提高了HBV基因亚型鉴定的特异性, 大大简化了过去通过DNA测序所需的繁琐步骤, 可用于大批量HBV基因亚型的筛选.

图1 Bj检测第二轮PCR产物酶切前后. 1-5为酶切前, 6-10为酶切后(均未被SpeI切动, 仍为110 bp大小片段), M为低分子量Marker.

图2 Ba检测第二轮PCR产物酶切前后. 1-5为酶切前, 6-10为酶切后(均被MseI切成89 bp大小片段), M为低分子量Marker.

2.2 鉴定结果

用该巢式PCR-RFLP法检测了B基因型的慢性HBV携带者和慢性重型乙型肝炎患者各25例, 结果均为Ba亚型.

3 讨论

HBV基因型与慢性乙型病毒性肝炎的关系一直是病毒性肝炎研究领域里的热点. 随着全基因分析[18]或S基因测序法[19]、PCR法[20-21]、PCR-RFLP法[22-26]、微板核酸杂交ELISA法[27-28]等HBV基因分型方法的相继建立和完善, 大量研究证实了HBV基因型与慢性乙型病毒性肝炎临床表现的相关性. 如西方学者[29]发现D型对HBV-DNA、HBsAg、HBeAg的清除率均比A型低, 死亡率较A型高. 而在流行B、C型的东亚地区, 研究者们[2-11]一致认为C型可引起比B型更严重的临床表现, 如ALT的升高、HBeAg阳性率的增加、重症中所占比例的增大. 但是, HBV基因型有时与临床不一定完全相关, 如日本B型HBV所致肝炎的症状一般都明显轻于中国B型HBV, 而且在以B基因型为主的中国南方地区, 慢性乙型病毒性肝炎的病情呈现多样化和复杂化, 提示在同一HBV基因型中可能还存在基因亚型或准种等因素影响着乙肝病情的转归和愈后.

本研究以50例B基因型HBV感染的慢性HBV携带者和慢性重型乙型肝炎患者血清为研究对象, 采用巢式PCR-RFLP法进行Ba和Bj基因亚型的鉴定, 希望进一步了解基因亚型与HBV致病性的关系, 从基因亚型这个角度诠释相同基因型HBV导致不同病情的机制. 但50例B基因型HBV感染的血清样品经鉴定均为Ba亚型, 这在一定程度上说明在湖南省内B基因型HBV主要还是Ba亚型, 与Sugauchi et al[15]报道的"中国以Ba亚型为主, 日本以Bj亚型为主" 相符. 虽然Sugauchi将B型HBV分为Ba和Bj两种亚型, 能在一定程度上解释中国等东亚地区B型HBV所致乙型肝炎病情较日本B型HBV为重的现象, 但在以Ba亚型为主的中国等地区, 表现为不同病情的B型HBV感染者普遍存在. 所以在HBV基因型的发病机制上, 除基因亚型外可能还有其他因素的影响(如HBV准种), 是值得进一步研究的课题.

备注

编辑:王谨晖 审读:张海宁

参考文献

1.	Lindh M, Andersson AS, Gusdal A. Genotypes, nt 1858 variants, and geographic origin of hepatitis B virus--large-scale analysis using a new genotyping method. J Infect Dis. 1997;175:1285-1293.  [PubMed]  [DOI]

2.

Orito E, Mizokami M, Sakugawa H, Michitaka K, Ishikawa K, Ichida T, Okanoue T, Yotsuyanagi H, Iino S. A case-control study for clinical and molecular biological differences between hepatitis B viruses of genotypes B and C. Japan HBV Genotype Research Group. Hepatology. 2001;33:218-223.  [PubMed]  [DOI]

3.	Chu CJ, Hussain M, Lok AS. Hepatitis B virus genotype B is associated with earlier HBeAg seroconversion compared with hepatitis B virus genotype C. Gastroenterology. 2002;122:1756-1762.  [PubMed]  [DOI]

4.	Sakugawa H, Nakasone H, Nakayoshi T, Orito E, Mizokami M, Yamashiro T, Maeshiro T, Kinjo F, Saito A, Miyagi Y. Preponderance of hepatitis B virus genotype B contributes to a better prognosis of chronic HBV infection in Okinawa, Japan. J Med Virol. 2002;67:484-489.  [PubMed]  [DOI]

5.	Sugauchi F, Chutaputti A, Orito E, Kato H, Suzuki S, Ueda R, Mizokami M. Hepatitis B virus genotypes and clinical manifestation among hepatitis B carriers in Thailand. J Gastroenterol Hepatol. 2002;17:671-676.  [PubMed]  [DOI]

6.	黄 晶, 高 志良. 乙型肝炎病毒基因型及其临床意义的研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:1362-1364.  [PubMed]  [DOI]

7.	Sumi H, Yokosuka O, Seki N, Arai M, Imazeki F, Kurihara T, Kanda T, Fukai K, Kato M, Saisho H. Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease. Hepatology. 2003;37:19-26.  [PubMed]  [DOI]

8.	Chan HL, Wong ML, Hui AY, Hung LC, Chan FK, Sung JJ. Hepatitis B virus genotype C takes a more aggressive disease course than hepatitis B virus genotype B in hepatitis B e antigen-positive patients. J Clin Microbiol. 2003;41:1277-1279.  [PubMed]  [DOI]

9.	Lee CM, Chen CH, Lu SN, Tung HD, Chou WJ, Wang JH, Chen TM, Hung CH, Huang CC, Chen WJ. Prevalence and clinical implications of hepatitis B virus genotypes in southern Taiwan. Scand J Gastroenterol. 2003;38:95-101.  [PubMed]  [DOI]

10.	许 军, 王 齐欣, 蒋 栋, 陈 红松, 魏 来, 王 宇, 杨 柳明, 赵 延龙. 乙型肝炎病毒基因型与病情轻重的关系. 中华肝脏病杂志. 2003;11:11-13.  [PubMed]  [DOI]

11.	温 志立, 谭 德明, 侯 周华, 杨 永峰. 型特异性巢式PCR研究HBV基因型与临床关系. 中南大学学报(医学版). 2004;29:50-53.  [PubMed]  [DOI]

12.	Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology. 2000;118:554-559.  [PubMed]  [DOI]

13.	Orito E, Ichida T, Sakugawa H, Sata M, Horiike N, Hino K, Okita K, Okanoue T, Iino S, Tanaka E. Geographic distribution of hepatitis B virus (HBV) genotype in patients with chronic HBV infection in Japan. Hepatology. 2001;34:590-594.  [PubMed]  [DOI]

14.	Sugauchi F, Orito E, Ichida T, Kato H, Sakugawa H, Kakumu S, Ishida T, Chutaputti A, Lai CL, Ueda R. Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination with genotype C over the precore region plus the core gene. J Virol. 2002;76:5985-5992.  [PubMed]  [DOI]

15.	Sugauchi F, Orito E, Ichida T, Kato H, Sakugawa H, Kakumu S, Ishida T, Chutaputti A, Lai CL, Gish RG. Epidemiologic and virologic characteristics of hepatitis B virus genotype B having the recombination with genotype C. Gastroenterology. 2003;124:925-932.  [PubMed]  [DOI]

16.	刘 映霞, 胡 国龄, 谭 德明. 湖南省乙肝病毒基因型分布及临床意义. 湖南医科大学学报. 2002;27:29-31.  [PubMed]  [DOI]

17.	温 志立, 谭 德明. 多对型特异性引物巢式PCR检测湖南省乙肝病毒基因型. 世界华人消化杂志. 2004;12:332-335.  [PubMed]  [DOI]

18.	Norder H, Hammas B, Lee SD, Bile K, Couroucé AM, Mushahwar IK, Magnius LO. Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen. J Gen Virol. 1993;74:1341-1348.  [PubMed]  [DOI]

19.	Borchani-Chabchoub I, Gargouri A, Mokdad-Gargouri R. Genotyping of Tunisian hepatitis B virus isolates based on the sequencing of preS2 and S regions. Microbes Infect. 2000;2:607-612.  [PubMed]  [DOI]

20.	杨 洁, 骆 抗先, 郭 亚兵, 戴 琳, 闫 丽, 候 金林. 乙型肝炎病毒基因型(A-F)多引物PCR分型法的初步建立. 中华肝脏病杂志. 2002;10:55-57.  [PubMed]  [DOI]

21.	王 永忠, 周 国平, 李 夏亭, 周 志武, 周 胜生, 阮 丽花, 陈 敏, 邓 为群. 乙型肝炎病毒基因分型及临床应用研究. 中华实验和临床病毒学杂志. 2002;16:367-369.  [PubMed]  [DOI]

22.	Kato H, Ruzibakiev R, Yuldasheva N, Hegay T, Kurbanov F, Achundjanov B, Tuichiev L, Usuda S, Ueda R, Mizokami M. Hepatitis B virus genotypes in Uzbekistan and validity of two different systems for genotyping. J Med Virol. 2002;67:477-483.  [PubMed]  [DOI]

23.	Li KS, Yamashiro T, Sumie A, Terao H, Mifune K, Nishizono A. Hepatitis B virus harboring nucleotide deletions in the core promoter region and genotype B correlate with low viral replication activity in anti-HBe positive carriers. J Clin Virol. 2001;23:97-106.  [PubMed]  [DOI]

24.	De Castro L, Araujo NM, Sabino RR, Alvarenga F, Yoshida CF, Gomes SA. Nosocomial spread of hepatitis B virus in two hemodialysis units, investigated by restriction fragment length polymorphism analysis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000;19:531-537.  [PubMed]  [DOI]

25.	阎 丽, 侯 金林, 郭 亚兵, 王 战会, 林 裕龙, 骆 抗先. 乙型肝炎病毒基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立. 中华传染病杂志. 2001;19:224-228.  [PubMed]  [DOI]

26.	丁 红兵, 郭 亚兵, 戴 琳, 阎 丽, 彭 吉力, 周 福元. RFLP基因分型在动态监测乙型肝炎病毒基因变异中的应用. 第一军医大学学报. 2001;21:81-84.  [PubMed]  [DOI]

27.	王 虹, 万 成松, 王 省良, 彭 华国. 采用PCR微板核酸杂交ELISA技术进行 HBV DNA基因分型的研究. 中华微生物学和免疫学杂志. 2001;21:234-236.  [PubMed]  [DOI]

28.	苏 冬娜, 吴 诗品, 石 之磷. HBV基因分型的检测及其意义. 临床荟萃. 2002;17:1303-1304.  [PubMed]  [DOI]

29.	Sánchez-Tapias JM, Costa J, Mas A, Bruguera M, Rodés J. Influence of hepatitis B virus genotype on the long-term outcome of chronic hepatitis B in western patients. Gastroenterology. 2002;123:1848-1856.  [PubMed]  [DOI]