修回日期: 2005-05-03
接受日期: 2005-05-14
在线出版日期: 2005-07-28
目的: 探讨人胃溃疡愈合过程中表皮生长因子(EGF)含量及表皮生长因子受体(EGFR)表达的变化及其作用.
方法: 采用放免及免疫组化方法, 对正常胃黏膜(10例)、胃溃疡活动期(GA组, 20例)、愈合期(GH组, 20例)、瘢痕期(GS组, 20例)胃液EGF含量及胃黏膜组织EGFR的表达进行测定及定位观察和图像分析.
结果: 正常胃黏膜和GA组的胃液EGF的含量分别为502.6±51.3、156.2±46.7 ng/L, 经统计学处理差异有显著性意义(P<0.05);GH和GS组胃液的EGF含量分别为386.1±76.8、466.3±95.4 ng/L, 与GA组比较, 差异有显著性意义(P<0.05).GA组胃黏膜EGFR的表达均较正常时增加, GH及GS组更加明显;GA组EGFRmRNA表达阳性密度(18.27±3.95)较正常组(8.52±1.18)增高(P<0.01), 而GH组(24.61±4.98)和GS组(27.92±5.44)又较GA组明显增高(P<0.05).
结论: 人胃溃疡愈合过程中, 胃液EGF与溃疡的发生和愈合有关, 胃黏膜EGFR的表达由弱到强.
引文著录: 谭永港, 舒晴, 邱猛进, 张永锋. 表皮生长因子及其受体mRNA在胃溃疡发生与愈合过程中的表达. 世界华人消化杂志 2005; 13(14): 1768-1770
Revised: May 3, 2005
Accepted: May 14, 2005
Published online: July 28, 2005
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(14): 1768-1770
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i14/1768.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i14.1768
表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)具有广泛的生物学作用, 主要有促进表皮生长, 增强正常细胞的再生能力及损伤修复作用[1];表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)主要分布在胃壁、十二指肠和小肠黏膜, 位于上皮的基底部. 近年的研究认为, 在导致溃疡发病的诸因素中, 可能涉及EGF的分泌及EGFR表达低下[2]. 我们采用放免及免疫组化方法, 对EGF及EGFR在正常胃黏膜、胃溃疡活动期、愈合期和瘢痕期的含量及表达情况进行了检测, 以探讨EGF及EGFR在胃溃疡愈合中的变化及作用.
胃溃疡患者均经内镜证实, 排除药物性溃疡、应激性溃疡或其他慢性病所致的溃疡患者. 胃溃疡分期采用日本学者畸田隆夫倡导的分期法, 将溃疡分为活动期(active stage)、愈合期期(healing stage)和瘢痕期(scarring stage). 选择其中活动期(GA组)、愈合期(GH组)和瘢痕期(GS组)患者各20例, 取胃液及胃黏膜标本, 另取10例正常胃黏膜的胃液及胃窦黏膜组织作对照.
1.2.1 胃液的收集: 上午内镜检查前禁食12 h, 禁用消泡剂, 经内镜活孔以聚乙烯朔料管抽吸胃液约2-3 mL, 置入试管中, 立即煮沸5-10 min, -20 ℃保存待测. 胃黏膜组织均取自溃疡边缘, 标本迅速浸入16 g/L多聚甲醛(以0.1 moL/L PBS配制, 含1 mL/L DEPC, pH为7.4)中固定16 h, 脱水, 常规石蜡包埋, 制备5 mm厚连续切片. SABC试剂盒、EGFR免疫组化试剂盒及EGFR原位杂交试剂盒均为武汉博士德生物工程公司产品, 原位杂交专用盖玻片、DEPC和多聚赖氨酸均为美国Sigma公司产品.
1.2.2 EGF含量的测定: 按试剂盒说明操作: 在平行双管中依次加入胃液0.1 mL, 125I-EGF 0.1 mL(内含放射性800 cpm左右)及EGF抗血清0.3 mL, 总体积为0.5 mL. 同时作标准曲线(测定范围为5-4 000 ng/L). 反应液经充分混匀后于4 ℃下放置48 h, 然后加入二抗及分离剂, 室温放置30 min, 离心(3 000 r/min, 15 min), 去上清, 沉淀以g-计数器读取cpm数. 计数B/B0, 在半对数纸上作出标准曲线并相应读出各管的EGF含量.
1.2.3 EGFR蛋白质检测: (1)切片常规脱蜡至水; (2)30 mL/L H2O2处理30 min以灭活内源性过氧化物酶; (3)复合消化液消化10 min; (4)正常山羊血清封闭20 min; (5)兔抗EGFR抗体37 ℃孵育60 min; (6)生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃孵育20 min; (7)SABC 37 ℃孵育20 min; (8)DAB显色; (9)苏木素复染. 分别以PBS和正常兔血清替代一抗作为阴性对照.
1.2.4 原位杂交法检测EGFRmRNA的表达: (1)所用玻片经清洗、200 ℃干5 h、2 mL/L氨丙基三乙氧基硅烷/丙酮液硅化、多聚赖氨酸包被处理. 切片充分脱蜡至水, 30 mL/L H2O2处理30 min, 双蒸水洗2 min×3次, 胃蛋白酶消化以暴露mRNA片段, 0.5 mol/L PBS洗5 min×3次, 双蒸水洗2 min×1次. (2)预杂交和杂交: 加预杂交液(含50 g/L甲酰胺、0.2 g/L十二烷基硫酸钠、300 mg/L鲑鱼精DNA、10 g/L牛血清白蛋白、2×SSC)于40 ℃预杂交2 h, 加20 mL含地高辛标记探针的杂交液, 盖上原位杂交专用盖玻片, 40 ℃杂交过夜. 30 ℃的2×SSC洗涤5 min, 共3次, 37 ℃的2×SSC洗涤5 min, 共3次. (3)抗原抗体反应与显色反应:50 g/L牛血清白蛋白封闭20 min; 兔抗地高辛抗体37 ℃孵育60 min, 0.5 mol/L PBS洗2 min×3次; 生物素化羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min, 0.5 mol/L PBS洗2 min×3次;SABC 37 ℃孵育30 min, 0.5 mol/L PBS洗5 min×4次;DAB显色; 苏木素轻度复染. 以不含探针的杂交液替代EGFR寡核苷酸探针杂交液作为阴性对照. 结果用计算机图像分析系统进行形态计量分析.
1.2.5 形态计量分析: 光学显微镜下观察显色反应, 阳性细胞胞质着色均呈棕黄色. 用高分辨摄像机摄像, 经计算机处理, 应用图像分析专用软件, 测定出阳性反应细胞密度(简称阳性密度), 每例从溃疡边缘至移行区随机测试5个以上高倍视野(×400), 计算出每个视野阳性密度的均值.
统计学处理 结果以mean±SD表示, 多组间比较用方差分析和q检验, 组内前后比较用t检验, P<0.05为差异有显著性意义.
正常胃黏膜的胃液EGF的含量为502.6±51.3 ng/L, GA组胃液EGF含量为156.2±46.7 ng/L, 经统计学处理差异有显著性意义(P<0.05); 而GH和GS组胃液的EGF含量分别为386.1±76.8 ng/L、466.3±95.4 ng/L, 与GA组比较, 差异有显著性意义(P<0.05). 表明胃溃疡患者胃液EGF含量明显降低, 当溃疡愈合时, 其胃液EGF含量亦明显增高, EGF与溃疡愈合、黏膜组织修复密切相关.
免疫组织化学染色显示, EGFR表达于黏膜层, 正常胃黏膜可见有少量阳性信号, 主要位于增殖区的颈黏液细胞和一些壁细胞. 在颈黏液细胞, EGFR定位于细胞顶膜表面, 有时在腺腔中有阳性信号, 此时常位于颈细胞相邻的黏液中; 而在壁细胞, 阳性信号则散布于整个细胞胞质. 有的表达于浆膜上. GA组溃疡周边及移行区黏膜阳性信号明显增多, GH组和GS组溃疡周边及移行区黏膜阳性信号较GA组显著增强, GS组更加明显.
原位杂交技术显示, 阳性细胞胞质着色呈棕黄色, 正常胃黏膜可见少量较弱EGFRmRNA阳性信号, GA组溃疡周边及移行区阳性信号增加, GH组和GS组溃疡周边及移行区黏膜阳性信号则较GA组明显增强. 此与免疫组织化学的结果一致. 图像分析结果显示:EGFRmRNA表达阳性密度GA组(18.27±3.95)较正常组(8.52±1.18)增高(P<0.01), 而GH组(24.61±4.98)和GS组(27.92±5.44)又较GA组明显增高(P<0.05), 说明随着溃疡的愈合EGFR表达增强.
近年来的研究表明, 消化性溃疡愈合质量的好坏与溃疡复发密切相关, 改善溃疡愈合质量可减少溃疡复发[3]. 溃疡的愈合过程十分复杂, 涉及到坏死物质的清除, 肉芽组织的生长、新生血管的生成、纤维组织及瘢痕组织的形成、上皮的重构等过程.
溃疡表面的上皮化是溃疡愈合的重要方面, 这主要依赖于EGF和EGFR的作用. EGF可抑制壁细胞分泌胃酸、促进黏膜细胞DNA、RNA及蛋白质合成. 对黏膜上皮及腺体的再生起重要作用, 但他必须与其受体EGFR结合, 以上作用才能得到发挥[4].GEFR是一带有酪氨酸激酶活性的跨膜粘蛋白, 广泛存在于人及哺乳动物的胃肠黏膜, 具有促进胃肠黏膜增殖、发育及修复, 减少胃酸分泌[5]等重要功能; 对EGF有高度的特异性和亲和力. 当GEF到达靶细胞表面时, 很快与细胞质膜上EGFR结合, 诱导其产生某种变构, 形成二聚体, 激活受体膜内区域的酪氨酸蛋白激酶, 使自身的一系列酪氨酸被磷酸化, 通过GrbZ和Sos最终激活p21ras而传导信号, 调节细胞生长与分化[6].
已有研究表明[7], 消化性溃疡患者胃液EGF含量明显降低. 我们发现, 胃溃疡患者胃液EGF的水平明显低于正常人, 与文献的报道一致, 提示EGF的降低可能与胃溃疡的发生有一定的关系; 溃疡愈合后其胃液EGF含量亦明显增高, 表明EGF在溃疡愈合中可能起作用. 本研究表明正常时胃黏膜有少量EGFR表达, 胃溃疡时表达增加, 随着溃疡的愈合则表达不断增强; 考虑系由于此时胃液EGF含量减少, EGFR为代偿性表达增强. 结果提示可通过增加EGFR的表达而促进黏膜上皮增殖, 从而加速溃疡重新上皮化和增加黏膜厚度, 乃至促进溃疡愈合和提高溃疡愈合质量, 如有些治疗胃溃疡的中药其作用靶点是通过增加胃黏膜EGFR的表达进而提高溃疡愈合质量, 从而达到抗消化性溃疡复发的目的[8].
编辑:张海宁
| 1. | 贺 建华, 罗 和生. 生长因子在消化性溃疡愈合中的作用. 国外医学•消化系统分册. 2003;23:12-15. |
| 5. | Joshi V, Ray GS, Goldenring JR. Inhibition of parietal cell acid secretion is mediated by the classical epidermal growth factor receptor. Dig Dis Sci. 1997;42:1194-1198. [PubMed] [DOI] |