1 HSP 家族的结构功能及分类
1.1 HSP的概念
HSP是指在热应激(或其他应激)下细胞合成或合成增加的一类蛋白, 并不是由细胞分泌到血浆或组织液中发挥作用, 而是在细胞内发挥作用, 属于非分泌性蛋白. HSP最初是在果蝇(drosophila)中被发现的. 早在1935年, 科学家就观察到加热果蝇的蛹可诱导发育缺陷型. 1962年遗传学家Ritossa et al[13]研究果蝇唾液腺染色体时发现, 正常果蝇幼虫的唾液腺中有多线染色体(polytenic chromosome), 他比一般染色体粗1 000-2 000倍, 在光镜下就可看见染色体. 将25 ℃培养的果蝇幼虫无意间置入30-32 ℃的环境中, 30 min后在其巨大的唾液腺染色体上发现了3个新的膨突(puff). 进一步观察认为, 热休克诱导的果蝇染色体膨突现象不存在组织和发育期的差异, 其膨突的生成与该区带基因的转录加强有关, 提示热休克时可能有某种蛋白合成的增加. 人们将这种现象称为热休克反应或热休克应答(heat shock response, HSR). 目前认为热休克反应是细胞对各种不利因素刺激所表现的一种以基因表达和调控方面发生改变的反应. 在这种反应过程中, 转录和翻译合成某些蛋白的基因被关闭, 而HSP基因打开, 产生一组HSP, 又称应激蛋白(stress protein, SP). 随后的研究发现, 一切生物细胞(包括原核细胞和真核细胞), 温度增高时均可合成一类具有生物学活性及其多种生理功能的蛋白. 不仅如此, 其他因素刺激, 如氧化磷酸化解联剂、重金属(汞、铜)、砷化物、氨基酸类似物(刀豆氨酸)、抗菌素(嘌呤霉素)、紫外线照射、饥锇、缺血或缺氧、创伤、感染、肿瘤、环境毒物、生长因子等200余种应激因素都能刺激诱导HSP的产生, 表现了其对物种的普遍性和高度保守性.
1.2 HSP的分类
HSP包括一个庞大的糖蛋白超基因家族, 分子质量为Mr6 000-170 000. 迄今为止, 已发现30余种, 根据同源程度及分子量大小分为HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP及泛素四组, 分子量大小为Mr110 000的HSP, 位于细胞质或细胞核中;Mr90 000的HSP家族, 包括HSP90和GRP94, 前者位于细胞质, 后者位于内质网ER;HSP90家族常见有HSP90、gp96(葡萄糖缺乏时诱导合成的一类蛋白)等. 其中HSP90指HSP90a和 HSP90b, 这两种蛋白具有相似或相同的功能, 都是细胞正常生长所必需的蛋白, 缺一不可. Mr70 000的HSP家族, 包括HSC70, GRP78(Bip)和GRP75, 分别位于细胞质、内质网和线粒体;Mr60 000的HSP位于线粒体; 低分子量HSP, 分子量Mr20 000-30 000, 位于细胞质或细胞核中;Mr10 000的HSP位于线粒体; 泛素(ubiquitin)分子质量为Mr8 000, 位于细胞质或细胞核. 其中分子量Mr70 000的HSP在正常细胞中较少, 但在应激状态下显著升高, 对他的研究也较多. 另一种分类是以其能否被诱导而分为结构型HSP(或称固有型)和诱生型HSP, 前者为细胞内正常的组成成分, 为细胞内的一种结构蛋白; 后者为细胞的诱生HSP, 通过诱导因素而产生. 诱生型HSP则在蛋白水平起防御、保护作用.
1.3 HSP的功能特征
HSP是存在于细胞的一种主要的分子伴侣(molecular chaperoner). 在细胞的生长发育、代谢分化、基因转录、维持组织细胞的自稳和环境适应性方面有很重要的作用. HSP最基本的结构为N端的一个具有ATP酶活性的高度保守序列和C端的一个相对可变的基质识别序列. 后者倾向与蛋白的疏水结构区相结合, 而这些结构区在天然蛋白中被折叠隐藏于内部而无法接近, 也就是说HSP倾向于与尚未折叠或因有害因素被破坏了其折叠结构的肽链结合, 并依靠其N端的ATP酶活性, 利用ATP促成这些肽链的正确折叠、移位、修复或降解[5].HSP是迄今为止从原核生物到真核生物, 一直到人类最为保守的蛋白[3], 生物在长期进化中, HSP是保留下来对抗损害进行自我保护的重要机制之一. HSP的共同特征为: (1)在热休克状态下优势表达, 而其他蛋白表达受抑制; (2)在所有细胞中均表达; (3)其氨基酸序列在进化中高度保守; (4)平时HSP主要存在于细胞质中, 应激时HSP迅速进入细胞核和核仁, 应激恢复期, 又迅速进入细胞质, 当再次应激时HSP又返回细胞核; (5)HSP可以提高抗应激能力, HSP70生成量与细胞耐热力成正相关; (6)在其基因启动子上游具有热休克元件, 能被特定的热休克因子启动而表达. HSP在细胞内的含量相当高, 约占细胞总蛋白的5%, 其功能涉及细胞结构的维持、更新、修复、免疫等. 经大量研究表明, HSP可从以下几个方面来发挥分子伴侣的作用: (1)在应激状态下保护细胞内蛋白的正常结构及维持细胞蛋白自身稳定; (2)作为分子伴侣使蛋白正确折叠或聚集, 参与多聚复合体的组装; (3)促使受损、变性蛋白的恢复; (4)加速降解和清除细胞代谢产物, 能重新激活某些酶的作用, 以维护细胞的功能和生存; (5)参与免疫应答; (6)调解信号传导通路; (7)调控细胞周期, 抑制凋亡; (8)促进微管的形成与修复.
2 HSP 与肝癌之间的关系
2.1 HSP70与肝癌
HSP70家族是多基因家族, 广泛分布在细胞的亚细胞结构中, 为可溶性胞质蛋白, 定位于内质网, 如胞质及胞核中组成性表达HSP70/HSP73, 胞质中热诱导表达HSP72(HSP70), PBP72/74(peptidebinding protein, PBP)等参与MHCⅡ类分子限制抗原呈递. 线粒体基质中存在GRP75(glucoseregulated protein, GRP), 内质网中有丰富的GRP78/BiP(immunol-globulin heavy chain binding protein, BiP).HSP70家族N端结构域高度保守, 具有ATP酶活性, ATP/ADP交换位点类似G肌动蛋白ATP酶结构域. HSP70家族C端结构域是结合多肽或特殊蛋白的部位, 类似MHC结合肽结构域, 同源性及功能差异大. HSP70家族成员具有翻译后磷酸化修饰, 多在Ser/Thr, 个别在Tyr(GRP75).HSP70家族在功能上具有一些共同特点: (1)所有HSP70具有ATP酶活性, 个别具有蛋白酶作用, 结合ATP后的构象改变促使靶蛋白与之解离, ADP-HSP70对靶蛋白具有更高亲和力, 形成HSP70蛋白复合体后稳定; (2)选择性结合多肽或特殊蛋白, 参与蛋白稳定构象形成、跨膜转运或降解; (3)HSP70蛋白复合体的形成需要其他HSP或细胞因子; (4)HSP70家族具有高度保守钙调素结合结构域. HSP70的表达既可以是快速强烈的诱导表达, 又可以是低水平组成性表达, 受热HSP自身负反馈调控. HSP70属诱生性HSP, 其诱导表达是多个三聚体热休克因子(heatshock factor, HSF)与热休克元件(HSE)顺反式协同作用的结果.
HSP具有潜在的非特异性内源性细胞保护功能, 这种细胞保护是指机体细胞在受到各种应激如高热、氧化等刺激时, 产生的HSP可以增强细胞对损害的耐受程度, 维持细胞的正常功能代谢, 提高细胞的生存率. HSP对肝细胞有免疫保护作用. Redaelliet al[14]研究发现肝热预处理后, 在肝组织中能明显观察到HSP32(HO-1)的表达, 并通过减轻肝微循环紊乱, 持续性抑制缺血后肝组织的损伤, 表现为肝细胞胆汁生成的恢复、肝脏酶释放的减少及肝组织水肿、损伤的减轻. 这说明HSP在肝组织中有保护作用, 其可能机制是: (1)直接作用, 即分子伴侣作用, 通过HSP的大量产生来维护细胞的生存和机能; (2)间接作用, 可能与氧自由基有关, HSP可以抑制NADPH氧化酶, 减少氧自由基的来源, 与糖皮质激素受体结合可促进SOD的生成, 减少氧自由基造成的脂质过氧化作用, 避免肝脏细胞的进一步被破坏.
HSP70被认为是肿瘤表面的特异性结构, 正常细胞表面并不表达HSP70[15]. 肿瘤形成过程中, 肿瘤细胞不断增殖, 合成代谢增强, 需要大量的HSP来调节和稳定这一异常增殖过程. 正常细胞中仅表达少量HSP70参与细胞的生长代谢, 并受细胞周期的严格调控, 而肿瘤细胞即使在无应激条件下, 也能独立于细胞周期持续高表达诱导型HSP70, 并呈现持续的高诱导表达异常分布和定位. 在病毒转化和化学诱导的肿瘤细胞中, HSP70的表达比正常细胞高几倍.
HSP70是HSP家族中的重要成员之一, 在多种肿瘤组织中表达上调, 为肿瘤的发生、发展所必需. 在许多恶性肿瘤(如乳腺癌、肠腺癌、肺癌等)中, HSP70的高表达与肿瘤的恶性程度及患者的无瘤生存期相关. 肿瘤细胞高表达的HSP70能与多种癌基因产物结合形成HSP70-癌蛋白复合物, 介导癌蛋白构象成熟及转运, 维持癌蛋白结构与功能的完整, 从而参与细胞的转化. HSP70作为肿瘤血清生物标志物在肝癌过度表达. Schueller et al[16]研究发现HSP70和90在热处理的肝癌细胞表达水平显著升高, 增加了肝癌细胞肿瘤免疫原性, 发挥HS肿瘤抗原的分子伴侣功能. 在随后的研究中发现HSP70和HSP90在经射频处理的人HCC细胞(SK-HEP-1)中过度表达, 提示HSP对宿主肿瘤的免疫反应调节是将来免疫治疗的重要策略.
肿瘤的发生是细胞的恶性增殖与细胞凋亡之间平衡失调的结果. HSP70的高表达增强了肿瘤细胞抗凋亡能力, 使细胞的生长抑制效应和死亡减弱. Lim et al[17]在研究肝癌中丰富的酪氨酸磷酸化蛋白时发现细胞骨架和应激蛋白小分子的酪氨酸激酶抑制剂可影响HSP70, HSC71和GRP75等分子伴侣蛋白与细胞骨架的高度磷酸化, 介导了细胞的流动性, 抑制细胞凋亡. HSP70的持续高表达通过调节肿瘤细胞代谢所必需的蛋白分子构象而发挥其参与细胞增殖、死亡的功能. HSP70可能与多种原癌基因(c-fos, c-myc, scr, raf, p53, Rb)相互作用, 介导其蛋白产物的构象成熟, 影响细胞周期, 调节细胞增殖[18].HSP70还参与了肿瘤细胞抗凋亡过程, 可能与Bcl2, Bcl-XL, Cr-mA等抗凋亡蛋白协调作用抑制细胞凋亡; 下调与细胞凋亡相关基因、蛋白和蛋白酶如SAPK/JNK和胱冬肽酶的活性, 从而达到拮抗细胞凋亡的作用[19].
大量文献报道, HSP70家族与突变p53的结合在调控p53功能方面起着重要作用. HSP70-p53复合物的存在可能与肿瘤的发生有关, 并可作为判断患者预后不良的指标. 崔崇伟et al[20]通过免疫组化、原位杂交及免疫荧光双标记激光扫描共聚焦显微镜等方法, 发现在肝癌组织中HSP70与p53的表达存在密切关系, p53核阳性者同时伴有HSP70核阳性. 并通过对3例HSP70与p53表达均呈阳性的标本进行免疫共沉淀, 从分子水平上证实, HSP70-p53复合物是肝癌发生、发展中HSP70调节p53功能的一种重要方式; 提示肝癌中存在基于HSP70-p53复合物的肿瘤主动免疫机制. HSP70对p53功能的调控可能有以下几方面: (1)HSP70的伴侣作用可使p53构象稳定, 以保护p53免受蛋白酶的降解, 并参与p53的胞质装配及核转运, 从而调控p53 的功能; (2)HSP70使p53在胞质中的半衰期延长, 可能是由于HSP70构象改变, 需要高浓度ATP才能使p53与HSP70解离; 亦有可能HSP70与p53结合后封闭p53的核定位序列, 导致p53在胞质积聚; (3)突变p53的构象改变暴露出结合HSP70的高亲和力位点, 亦可能使p53在胞质积聚, 胞核中HSP70与p53结合DNA结构域结合, 封闭p53结合DNA的功能, 使p53失去调控蛋白的作用, 从而促进肿瘤的发生、发展; (4)HSP70在抗原加工、呈递中作用, 提示HSP70与突变p53结合, 可能介导肿瘤特异抗原p53的降解及呈递, 引起机体对p53的免疫反应. HSP70在肿瘤免疫中的这种作用, 提示HSP70与突变的p53结合, 可能介导突变的p53作为肿瘤抗原的降解及呈递, 引起机体对p53的免疫应答. 因此, 利用HSP70能与肝癌组织来源的p53结合形成HSP70-p53复合物的这一特性, 可望研制出新型、高效的特异性抗肝癌疫苗.
2.2 HSP90与肝癌
HSP90家族在氨基酸序列上高度保守, 如白色念珠菌与其他真菌、脊椎动物和植物的HSP90相比有61-79%的同源性. HSP90的C端是寡聚化结构域, 能结合底物蛋白, 类似蛋白酶结合底物口袋. C端最后4个氨基酸都是glu-glu-val-asp(锥虫第2个glu被gln取代), 有趣的是该结构同样存在于真核生物的HSP70当中, 这是HSP70与HSP90在结构上唯一的相似处, 提示该结构具有重要的生物学意义. gp96是HSP90家族的成员, 位于内质网腔, N端具有跨膜序列, C端有内质网腔定位序列, 同样具有glu-glu-val-asp结构, 用从肿瘤组织中制备的gp96免疫小鼠能产生抗相应肿瘤细胞的特异性保护性免疫应答, 而从正常组织分离的gp96没有这种作用. gp96是一种高度保守和单态性蛋白. 他具有分子伴侣功能, 能与细胞内大量多肽非共价结合而不受细胞单倍型和MHC分子的影响. gp96-肽复合物也可在体外形成, 并具有与体内相似的免疫活性. gp9参与MHCⅠ类抗原的提呈. 用肿瘤源gp96-肽复合物免疫小鼠可诱发抗相应肿瘤细胞的MHCⅠ类限制性CD8+细胞毒性T细胞免疫应答, 并能产生记忆性T细胞应答, 具备了作为疫苗的一个关键要素, 与其他肿瘤源蛋白相比, gp96是一个有效的抗肿瘤疫苗, 能更加有效的激发抗原特异性CTL反应[21].gp96是单态分子, 结合的肽源于细胞蛋白, 反映细胞蛋白构成, 因此, 从任何类型细胞制备的gp96均含有该特定类型细胞肽池的所有成分. gp96-肽复合物很有希望成为新一代抗肿瘤疫苗.
目前全世界共有3.5亿乙肝病毒感染者, 我国约有1.7亿. 目前应用的乙肝疫苗可预防乙肝感染, 但对已感染乙肝病毒特别是已经发展成慢性肝炎、肝硬化和肝癌的患者, 还没有有效的治疗药物. Meng et al[22]研究发现乙肝病毒特异多肽与热休克蛋白gp96的复合物, 为慢性乙肝、肝硬化和肝癌的免疫治疗开创了新途径, 但HBV体内复制、组装过程的具体机制至今尚未弄清. 陆荫英et al[23]综述了分子伴侣中的一些成员HSP90, HSP70, HSP60, 葡萄糖调节蛋白94(GRP94)及钙连接蛋白(calnexin)等在HBV的生命周期中扮演了重要的角色, 表明HSP在肝炎以及肝癌的发生、发展中有意义. HSP90与人类肿瘤发生有较密切关系, Lee et al[24]应用strategic shotgun proteomics approach研究肝细胞瘤目标蛋白基因表达谱发现, 在Hep3B细胞中HSP90的表达显著升高, 而且与端粒的长短有关. 可见HSP90的表达水平发挥分子伴侣功能启动端粒酶和端粒结合蛋白的表达, 与HCC的发生有重要关系. HSP90参与肝细胞相关蛋白磷酸化作用的调节和蛋白酶体降解通路. Huang et al[25]发现肝细胞唾液酸糖蛋白缺乏和转铁蛋白受体磷酸化作用使gp96, HSP70, HSP90表达增高, 表明当磷酸化作用缺失时, 唾液酸糖蛋白细胞质结构域需要特异的分子伴侣结合后才能发挥调节作用. Gusarova et al[26]报道apoB是重要的肝载脂蛋白, apoB的网络作用可被前分泌降解介导的泛醌素蛋白酶体路径和HSP70调节, 同时HSP90和HSP70共同参与了这种内质网相关apoB与蛋白酶体路径的蛋白降解作用. 因脂肪肝的发生与载脂蛋白的分泌有直接关系, 因此HSP也参与了脂肪肝的发病机制.
HSP90作为基因疫苗的应用可以治疗肿瘤. 刘宪玲 et al[27]用反义核酸技术将反义HSP90重组子导入胃癌细胞系后, 发现HSP90生长受抑, 这些转染细胞生长亦受到不同程度抑制. G1期细胞明显增多, S期细胞明显减少, G1期被阻滞. 可以看出, HSP90与细胞生长有关, 通过抑制HSP90的表达可抑制肿瘤细胞生长.
2.3 HSP47与肝癌
HSP47是一种分子量为Mr47 000的HSP, 属小分子量HSP家族. HSP47存在于胶原蛋白分泌细胞的ER内, 与前胶原特异性结合, 参与前胶原的折叠、装配、修饰、转运等过程, 被认为是胶原特异性分子伴侣, 在胶原合成及纤维化病理过程中发挥着重要作用. HSP47在ER内的作用可能包括以下几方面[28]: (1)防止新合成前胶原a链的错误聚集, 帮助形成正确的三股螺旋结构. 在HSP47基因敲除的小鼠模型中观察到HSP47缺失情况下, Ⅰ型胶原a链不能形成正确的三股螺旋结构[29]; (2)参与前胶原肽链的修饰. 在单独应用Ⅲ型前胶原cDNA和应用HSP47及Ⅲ型前胶原cDNA共同转染293细胞的对比实验中观察到无HSP47存在情况下, Ⅲ型前胶原被过度修饰, 说明HSP47参与了前胶原的修饰过程; (3)防止前胶原肽链在ER内的降解. HSP47的存在可以防止前胶原肽链的降解, 这可能与HSP47属于serin家族有关, 但目前尚未发现HSP47具有丝氨酸蛋白酶抑制物活性; (4)稳定前胶原的三股螺旋结构, 防止三股螺旋形式前胶原的束集. 大多数分子伴侣的作用是在其作用底物折叠装配过程中稳定其中间产物, 而HSP47却与成熟的三股螺旋形式的前胶原结合, 一方面可能是帮助稳定三股螺旋结构, 另一方面可能是防止三股螺旋前胶原的进一步束集[30]; (5)对前胶原形成的质量控制, 防止结构错误的前胶原泌出ER. 采用a, a'-联吡啶抑制三股螺旋结构形成实验中, 可见ER内大量新合成的前胶原肽链与HSP47的复合体滞留, 提示HSP47可能具有阻止未成熟或错误折叠的前胶原泌出ER的功能; (6)协助前胶原分泌. 利用反义RNA转染成纤维细胞, 抑制HSP47合成, 则可抑制前胶原分泌, 但其他胞外基质成分不受影响. 说明正常状态下HSP47有利于前胶原分泌.
HSP47的表达受多种转录因子的调节. HSP47一般在热休克(42-45 ℃)及其他因子刺激后表达明显增加. HSP47基因转录起始区含有高度保守的热休克元件(HSE)序列. 在高等脊椎动物体内已发现四种热休克因子(HSFs), 分别标识为HSF1, HSF2, HSF3, HSF4, 其中HSF1是应激状态下的主要转录因子. 正常状态下, HSF1以单体形式存在, 应激状态下, HSF1形成三聚体形式, 进入胞核与HSE结合, 启动HSP47基因的转录. 应激状态下的HSP47基因转录是通过HSF-HSE间作用诱导起始的[28].HSP47的表达受到多种细胞因子的影响. 在不同的培养细胞中观察到, 转化生长因子-b1(TGF-β1)、白介素-4(IL-4)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)可使细胞HSP47 mRNA及其蛋白表达上调. 相反, 干扰素-(INF-g)、表皮生长因子(EGF)可使HSP47 mRNA及其蛋白表达下调. 这些细胞因子在调节HSP47分泌增减的同时同步调节着胶原mRNA及其蛋白表达的升降[31].
组织器官纤维化及硬化的主要病理改变是细胞外基质(ECM)的异常合成和堆积. 胶原蛋白是胞外基质的重要组成部分, HSP47作为胶原特异性分子伴侣, 在此过程中发挥着重要作用. 对多种疾病模型和人类组织纤维化的病理研究均证实, HSP47的表达上调与胶原合成增加及纤维化进展在时间和分布区域上呈正相关. 抑制HSP47表达可抑制胶原合成, 减弱纤维化程度. 慢性肝炎病毒持续感染会导致肝纤维化, 如果这种纤维化不可逆, 就会引起肝硬化甚至肝癌. 病理状态下, 大量分泌的HSP47则主要来自于异常增生的表型转化细胞. 在肝纤维化区域, 可见大量结合蛋白(desmin)阳性的脂肪细胞. 这些表型转化细胞是纤维化区域胶原蛋白的分泌细胞, 同时均高表达HSP47, 这种HSP47与胶原表达的一致性与HSP47的胶原特异性分子伴侣功能相吻合[31].Park et al[32]在CCl4造模的慢性肝损伤HSP70敲除的转基因小鼠检测发现经过6 wk的CCl4处理, HSP70-/-小鼠ALT水平低于对照组. HSP25和HSP47的表达水平也低于对照组, 肝坏死分级和嗜酸性粒细胞浸润在HSP70-/-和对照小鼠之间没有显著性差异, CCl4处理的小鼠没有显著改变肝胶原的产生Nagata et al[28]通过破坏小鼠HSP47基因, 发现HSP47缺失的小鼠胚胎有错误的三股螺旋折叠形成, 在这些小鼠的间充质细胞和上皮细胞中没有发现胶原的形成, 最终导致胚胎死亡, 可见, HSP47是小鼠发育所必需的; 多组织表达检测发现HSP47在肝、肾、肺等多组织纤维化中显著上调, 表明通过下调HSP47的表达, 减少组织胶原的积累, 可作为肝纤维化基因治疗的新策略. HSP47作为一种胶原特异的分子伴随, 不仅参与纤维化/硬化疾病的形成, 而且还在损伤修复和组织重建中起到重要作用. 郭津生et al[33]采用免疫组织化学方法检测了6例肝癌手术切除标本及乙酸诱导后不同时间大鼠胃溃疡组织标本内HSP47的表达和定位. 结果发现人肝癌包膜、癌旁肝纤维化纤维间隔内的纤维细胞以及在纤维间隔附近肝细胞周围的星状细胞表达HSP47蛋白. 大鼠胃组织内成纤维细胞、血管内皮细胞以及平滑肌细胞均有HSP47蛋白的表达. 溃疡基底肉芽组织内大量增生的成纤维细胞、小血管内皮细胞表现HSP47蛋白强阳性染色. 可见HSP47的表达在肝癌、肝纤维化的发生有重要意义.
2.4 HSP27与肝癌
HSP27的表达是在转录和翻译两个水平上进行调节的, 但前者更为重要. HSP基因上游序列中存在一个热休克反应元件(heat shock element, HSE), 由3个以上的nGAAn核心序列重复排列构成. HSE作为HSP基因的顺式作用元件, 在与作为反式作用因子的热休克转录因子结合以后, 启动该HSP基因的表达. HSP27具有HSP亚家族的显著特点: 在细胞内可表现为单体/二聚体, 甚至Mr70 000的寡聚体. HSP生物体内有两种表达形式: 诱导型主要在外界环境的刺激下表达, 具有保护细胞的功能; 构成型主要在生理状态下表达, 与细胞的分化、发育密切相关.
HSP27在肿瘤的发生、发展及预后中也起了关键作用. 研究发现, 高度表达HSP27的细胞, 其发生多种肿瘤, 如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌等的危险性大大增高, 且预后较差, HSP27可作为肿瘤预后好坏的可信指标之一[34]. 活性氧(reactiveoxygen species, ROS)是由外源性氧化剂或胞内有氧代谢中产生的、具有很高生物活性的氧自由基, 可直接损害或通过一系列过氧化链式反应引起广泛的生物大分子结构破坏, 并可直接改变细胞内环境稳定性. 在一些特定条件下, 如病毒感染、缺血、缺氧、离子辐射、紫外线照射、化疗药物、化学试剂等都可通过介导活性氧的产生而导致细胞凋亡的发生. HSP27参与氧化应激保护细胞氧化损伤. Katsuki et al[35]报道HSP27能降低细胞中的ROS水平、延缓脂质过氧化及胞质蛋白的氧化等相关过程. 还原型谷胱甘肽(GSH)是细胞合成的、胞内重要的水溶性抗氧化剂. 实验证明, 组成性表达和诱导性表达增加HSP27的过度表达, 启动了通过促进GSH自身的氧化还原循环, 提高葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性, 使胞内GSH的水平增高, 对TNF-α或放射线等其他类型的氧化损伤具有保护作用.
慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝纤维化, 肝硬变, 肝脂肪变和肝细胞癌的发生紧密相关. HCV病毒RNA的NS5A蛋白是一种具有广泛反式激活作用的蛋白分子, 其羧基末端富含酸性氨基酸及脯氨酸. NS5A主要定位于细胞ER, NS5A可能参与了细胞信号转导途径, 通过JAK1介导STAT3的激活. NS5A蛋白能够下调Bcl-2和细胞周期调节基因p21WAF1的表达, HCV NS5A对于p21WAF1表达的抑制, 实际上就是对于细胞周期的促进作用[36]. Choi et al[37]研究HCV非结构蛋白NS5A和NS5B的结合蛋白发现, HSP27与NS5A结合而不与NS5B结合, NS5A氨基端1-181氨基酸位点, HSP27氨基端1-122氨基酸位点是二者相互作用的结合域. HSP27普遍存在于细胞胞质内, 当热应激时, HSP27在内质网与NS5A有共同锚定作用. 近年研究结果还证实, NS5A蛋白还具有结合载脂蛋白AI、AII的功能, 在肝脏脂肪滴中也见到了NS5A的存在. 因此, 认为NS5A蛋白在慢性丙型肝炎、肝脏脂肪变(steatohepatitis)的发病中也有重要地位[38]. 不同磷酸化形式的NS5A蛋白具有反式激活作用也是目前关于NS5A生物学功能研究的热点, 推测NS5A蛋白的这种反式激活作用, 可能是HCV感染与HCC发生、发展密切相关的重要分子生物学机制[39-41].
HSP27可以抑制细胞凋亡, 保护肝细胞损伤. HSP27磷酸化使HSP27从寡聚体变为二聚体, 并与Daxx结合, 阻止了Daxx由胞核向胞质的转位以及与Fas、Ask1的结合, 使该凋亡通路中断. 然而, 当细胞表达寡聚体形式的HSP27或缺乏Daxx结合能力的突变体时, HSP27不能发挥抗凋亡作用[42]. 可见, HSP27与死亡受体Fas介导的凋亡途径密切相关. 但De Miglio et al[43]研究发现HCC细胞中HSP27在肝小丘过度表达, 但不出现显著地保护非典型损害抑制凋亡. 因此, 对于HSP27在肝癌细胞的作用机制尚需深入探讨.
总之, HSP与肝癌的研究已经取得了一定的进展. 由于HSP具有分子伴侣、抗氧化、协同免疫以及抗细胞凋亡等多种功能, 且这些功能对于肝损伤的治疗有积极的作用, 从而为肝癌的治疗供了一条新思路. 人们发现肿瘤自体产生的HSP结合了肿瘤抗原, 引起特异性反应, 但这种特异性由结合的多肽抗原决定. 源于肿瘤组织的HSP本身并非抗原, 而是作为抗原载体发挥作用, 可以增加抗原的免疫原性, 激发肿瘤特异性T淋巴细胞, 从而杀伤肿瘤细胞. 因此, 人们提出HSP可以作为肿瘤免疫的分子佐剂发挥免疫防治作用. 正确认识HSP效应, 能帮助我们进一步了解肝癌的发生和发展, 并为其治疗提供新途径. 然而有关HSP治疗肝癌途径的研究仍存在着许多问题, 且HSP一般在应激条件下才能大量产生, 其抑制肿瘤的作用机制还需要进一步阐明. HSP家族在肝癌组织中过度表达, 可以作为肝癌发生的血清生物标志物, 对于肝癌的诊断和预后有指导意义. 随着学者们对HSP分子生物学和免疫学机制研究的深入, 随着HSP70基因疫苗的研究的不断发展, gp96, HSP90, HSP27也受到了肿瘤研究者的关注[44-45]. 所以, HSP蛋白这一古老家族, 已经成为肿瘤免疫治疗的一个新制高点. 进一步了解HSP家族多种蛋白在肝癌及其他器官肿瘤发生、发展中的作用以及抗肿瘤机制将成为今后继续研究的重要课题.
