肝癌组织中TGF-β1、TGF-β1RⅡ和NF-κB的表达

摘要

目的: 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β1Ⅱ型受体(TGF-β1RⅡ)、核转录因子-kB(NF-κB)在肝细胞癌(HCC)中表达.

方法: 在30例肝癌组织和癌旁肝组织中, 用免疫组化技术, 分别检测TGF-β1 TGF-β1RⅡ及NF-κB蛋白的表达; 用原位杂交方法检测TGF-β1mRNA的表达, 以CD34标记血管内皮细胞, 观察TGF-β1及TGF-β1RⅡ蛋白与微血管密度(MVD)、TGF-β1蛋白与TGF-β1mRNA、NF-κB与TGF-β1的关系.

结果: 肝癌组织TGF-β1mRNA平均光密度明显高于癌旁组织(0.1043±0.035 vs 0.0620±0.0225, P<0.01)、TGF-β1蛋白平均光密度表达明显高于癌旁组织(0.0725±0.0102 vs 0.0442±0.0103, P<0.01); 肝癌组织TGF-β1RⅡ蛋白平均光密度表达明显低于癌旁组织(0.0402±0.0113 vs 0.0669±0.0157, P<0.01); 肝癌组织NF-κB蛋白表达均明显高于癌旁组织(0.0723±0.0210 vs 0.0305±0.0116, P<0.01), 肝癌组织MVD明显高于癌旁组织(31.23±9.25 vs 4.24±2.10,P<0.01), 肝癌组织TGF-β1蛋白阳性表达与MVD呈正相关(t = 3.25, P<0.01);TGF-β1 mRNA与TGF-β1 蛋白呈正相关(χ² = 8.21, P<0.01);NF-κB蛋白阳性表达与TGF-β1蛋白阳性表达呈正相关(χ² = 9.075, P<0.01); 而TGF-βRⅡ蛋白与MVD呈负相关.

结论: 肝癌组织中TGF-β1基因的变化发生在多个水平, 肝癌细胞中TGF-β1RⅡ、NF-κB蛋白表达异常, 并与MVD相关, 提示他们在肝细胞癌血管形成中发挥重要作用, NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用.

关键词: 转化生长因子b1; 转化生长因子b1Ⅱ型受体; 核转录因子-kB; 肝细胞癌

Expression of TGF- b1, TGF-β1RII and NF-k B in hepatocellular carcinoma

Lin Miao, Suo-Lin Zhang, Guo-Zhong Ji, Zhi-Ning Fan, Zheng Liu, Ping Zhang, Chun Yang

Lin Miao, Guo-Zhong Ji, Zhi-Ning Fan, Zheng Liu, Ping Zhang, Chun Yang, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China

Suo-Lin Zhang, Department of Gastroenterology, Danyang People'S Hospital, Zhenjiang 212300, Jiangsu Province, China

Supported by: Natural Science Foundation the Department of Education of Jiangsu Province, No. 02KJD320023.

Correspondence to: Lin Miao, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, Jiangsu Province, China. miaofrest@yahoo.com.cn

Received: April 11, 2005
Revised: April 22, 2005
Accepted: April 27, 2005
Published online: July 28, 2005

Abstract

AIM: To explore the expression of TGF-β1, TGF-β1RII and NF-κB in hepatocellular carcinoma (HCC) tiussues.

METHODS: Immunohistochemistry was used to detect the expression of TGF-β1, TGF-βRII and NF-κB protein in 30 HCC and the corresponding cancer-adjacent tissues. The expression of TGF-β1 mRNA was determined in 30 HCC and the corresponding cancer-adjacent tissues by in situ hybridization. Vascular endothelial cells were labeled with CD34 to observe the microvessel density (MVD). Then the relationships between TGF-β1 protein and MVD, TGF-β1RII protein and MVD, NF-κB and TGF-β1 protein as well as between TGF-β1 protein and mRNA were analyzed.

RESULTS: The expression of TGF-β1 protein and mRNA in HCC tissues were significantly higher than those in the cancer-adjacent tissues (Mean optical density: 0.0725±0.0102 vs 0.0442±0.0103, P < 0.01; 0.1043±0.0350 vs 0.0620±0.0225,P < 0.01). The MVD in HCC tissues was also markedly higher than that in the cancer-adjacent tissues (31.23±9.25 vs4.24±2.10, P < 0.01). The level of NF-κB expression was significantly higher than that in the cancer-adjacent tissues (0.0723±0.0210 vs 0.0305±0.0116, P < 0.01), while the level of TGF-βRII was lower (0.0402±0.0113 vs 0.0669±0.0157, P < 0.01). Obviously positive relationships existed between TGF-β1 protein and MVD (t = 3.25, P < 0.01), TGF-β1 mRNA and TGF-β1 protein (χ² = 8.21, P < 0.01) as well as between NF-κB and TGF-β1 protein (χ² = 9.075, P < 0.01), but the expression of TGF-β RIIprotein was negatively related to MVD.

CONCLUSION: TGF-β1, TGF-β1RII and NF-κB protein is abnormally expressed in HCC tissues and they are significantly related to MVD. They may play important roles in the angiogenesis of hepatocellular carcinoma. NF-κB may mediate the activation and production of TGF-β1.

Key Words: Hepatocellular carcinoma; TGF-β1; TGF-β1RII; NF-κB

0 引言

转化生长因子-β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是TGF-β超家族的主要成员, 能抑制肝细胞、内皮细胞、上皮细胞的增生, 诱导细胞外基质的形成[1-3]. 其受体有3种, 即TGF-βRI、TGF-βRII、TGF-βRIII. 研究表明他们在多种肿瘤中存在异常[4-6]. 转化生长因子的合成是由核转录因子(如NF-κB)来调控的. 有关其在肝细胞癌中表达情况目前报道不多. 我们研究TGF-β1及TGF-β RII、NF-κB在肝癌组织的表达, 并研究其与微血管密度(MVD)的关系; 同时研究NF-κB蛋白与TGF-β1蛋白阳性表达之间的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

原发性肝细胞癌标本30例, 来自本院病理科存档石蜡包埋标本, 蜡块连续切片, 厚度为4 mm, CD34抗体为即用型, 购自北京中山生物技术有限公司. TGF-β1、TGF-β1RII、NF-κB抗体(浓缩型)为Santa Cruz公司产品(北京中山生物技术有限公司).

1.2 方法

TGF-β1、TGF-β1RII、NF-κB蛋白表达及MVD的测定: 采用链霉素亲生物素-过氧化物酶法(SP法).MVD采用CD34抗体标记法, 稀释滴度均为1:100. 步骤如下: 石蜡切片常规二甲苯脱蜡至水; 3% H₂O₂室温孵育10 min, 以消除内源性过氧化物酶活性;PBS冲洗; 分别滴加CD34抗体、TGF-β1抗体、TGF-β1RII抗体、NF-κB抗体(一抗), 室温下过夜; PBS冲洗; 滴加生物素标记的二抗, 37 ℃孵育30 min; PBS冲洗; 滴加辣根酶标记链霉卵白素, 37 ℃孵育30 min; PBS冲洗; DAB显色, 封片观察. 对30例原发性肝细胞癌及癌周标本进行原位杂交染色. 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司, 按试剂盒说明书操作. 免疫组化以细胞核或胞质着色棕黄色颗粒为阳性细胞, 原位杂交以细胞核或胞质着色紫兰色颗粒为阳性细胞. CD34染色深褐色条索状细胞簇为微血管.

微血管密度(MVD)按Weidner方法进行[7]:CD34抗原染色后, 在低倍镜下(×100)找出微血管最密集区, 再在高倍镜下(×400)计算5个视野被染成棕色的血管数目, 取其平均值作为微血管密度. TGF-β1、TGF-β1RII、NF-κB免疫组织化学结果: 全部切片在显微镜下观察, 阳性判断标准为: 上皮细胞或癌细胞胞核或胞质染色呈棕黄色或棕褐色颗粒, 阴性: 胞核或胞质不着色. 对所有TGF-β1、TGF-β1RII、NF-κB蛋白阳性切片进行图像分析, 每张切片放大200倍, 随机选取5个视野, 测量窗面积为430 205 mm², 分别测量阳性细胞面积比(Na%)(阳性反应面积/测量窗面积)和阳性细胞平均吸光度(A). 对所有TGF-β1mRNA阳性切片进行图像分析, 方法同免疫组化. 资料分析采用瑞医RY2000病理图文分析系统.

统计学处理 采用t检验和χ²检验.

2 结果

2.1 肝癌组织TGF-β1、TGF-β1RII蛋白的表达

肝癌组织TGF-β1蛋白明显高于癌旁组织, 经统计学处理二者差异均有显著性(P<0.01); 肝癌组织TGF-β1RII蛋白明显低于癌旁组织, 经统计学处理二者差异均有显著性(P<0.01)(表1, 图1A).

表1 肝癌组织TGF-β1 TGF-β1RⅡ蛋白的表达(mean±SD).

	TGF-β1蛋白			TGF-β1RⅡ蛋白
	n	A	Na%	n	A	Na%
肝癌	20	0.0 725±0.0 102b	62.45±11.56b	16	0.0 402±0.0 113b	30.21±14.24b
癌旁	20	0.0 442±0.0 103	23.26±15.35	16	0.0 669±0.0 157	58.33±13.85

^bP<0.01 vs癌旁组织.

图1 肝癌组织中 TGF-β1蛋白、TGF-β 1mRNA及MVD的表达(× 200). A: TGF-β1蛋白; B: TGF-β1mRNA; C: MVD.

2.2 肝癌组织TGF-β1 mRNA、NF-κB蛋白、MVD的表达

30例原发性肝细胞癌及癌周标本TGF-β1 mRNA阳性例数分别为17例和15例, 肝癌组织TGF-β1 mRNA明显高于癌旁组织, 肝癌组织中NF-κB蛋白明显高于癌旁组织, 肝癌组织中微血管密度明显高于癌旁组织, 统计学处理二者差异均有极显著性(表2, 图1B-C).

表2 肝癌组织TGF-β1 mRNA、NF-κB蛋白、MVD的表达的表达(mean±SD).

	TGF-β1 mRNA			NF-κB蛋白			微血管密度
	n	A	Na%	n	A	Na%	n	MVD
肝癌	17	0.1 043±0.035b	52.20±10.46b	20	0.0 723±0.0 210b	60.25±12.04b	30	31.23±9.25
癌旁	15	0.0 620±0.0 225	32.54±11.21	17	0.0 305±0.0 116	28.11±10.45	30	4.24±2.10

^bP<0.01 vs癌旁组织.

2.3 肝癌组织中TGF-β1蛋白表达的相关性

肝癌组织TGF-β1蛋白阳性表达组微血管密度明显高于TGF-β1蛋白阴性表达组, 统计学处理二者差异有显著性(P<0.01)(表3); 肝癌组织TGF-β1蛋白、TGF-β1 mRNA表达均阳性者占50.0%(15/30), TGF-β1蛋白、TGF-β1 mRNA表达均阴性者占26.7%(8/30), 二者表达一致率达76.7%(23/30), 统计学处理二者呈显著相关(χ² =8.21, P<0.01); 肝癌组织TGF-β1蛋白、NF-κB蛋白表达均阳性者占56.7%(17/30), TGF-β1蛋白、NF-κB蛋白表达均阴性者占23.3%(7/30), 二者表达一致率达80.0%(24/30), 统计学处理二者呈显著相关(χ² = 9.075, P<0.01)(表4).

表3 肝癌组织中TGF-β1蛋白的表达与微血管密度的关系(mean±SD).

		n	微血管密度(MVD)
TGF-β1蛋白	+	20	35.65±12.87
	+	10	25.12±4.68

t = 3.25, P<0.01.

表4 肝癌组织中TGF-β1蛋白与TGF-β1 mRNA、NF-κB蛋白之间的关系.

		TGF-β1 mRNA			NF-κB蛋白
		+	-	合计	+	-	合计
TGF-β1蛋白	+	15	5	20	17	3	20
	-	2	8	10	3	7	10
合计		17	13	30	20	10	30

3 讨论

肿瘤的生长、侵袭及转移依赖于血管生成, 肿瘤不仅通过肿瘤血管获得丰富的营养物质, 而且还通过肿瘤血管向外输出肿瘤细胞, 导致肿瘤不断生长和转移. 肿瘤的微血管密度是反映肿瘤血管生成的有效指标, 在活体, Chen et al[8]报道可采用动态螺旋CT增强扫描来反映肝癌微血管密度. 在离体标本中, 目前常采用标记血管内皮的方法来检测肿瘤的微血管密度, 而CD34和VIII因子是常采用的标记方法. 而CD34和VIII因子是常采用的标记方法. Poon et al[9]报道肝癌组织中MVD明显高于癌旁组织, 且肝癌组织中MVD与肝癌预后相关, MVD高, 预后差. 本研究结果同样显示, 肝癌组织中MVD明显高于癌旁组织, 进一步说明了肿瘤血管生成在肿瘤发生发展中的重要作用. TGF-β是细胞生长、分化重要调控因子, 其有5个亚型:TGF-β1-5, 在哺乳动物只有TGF-β1, 2, 3, 三者的生物学作用相似, 序列同源性70-80%, 其中TGF-β1含量最高, 有代表性. TGF-β受体有3种, 即TGF-βRI、TGF-βRII、TGF-βRIII. 他们相对分子质量分别为65×10³, 85-110×10³和6×10^5. 起信号转导作用的是Ⅰ型和Ⅱ型受体.Ⅰ、Ⅱ型受体都是单次跨膜的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体. 胞膜外区较短, 胞质区较长. 胞膜外区富含半胱氨酸. 胞质区含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域, 具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性. 与Ⅱ型受体相比, Ⅰ型受体的胞外区和胞质区均较短. TGF-β1首先与TGF-βRII结合形成二聚体, 而后TGF-βRI加入形成三聚体, 参与信号转导. TGF-β1对肝细胞增殖具有强烈的抑制作用. 例如在肝大部切除肝再生后期, 正是由于肝组织中TGF-β1的大量表达, 才导致肝再生的自然终止. 另外, TGF-β1在很低浓度(<20 pmol/L = 即可诱导肝细胞凋亡[10], Kim et al[11]亦同样证实TGF-β1诱导肝细胞凋亡. 因此, TGF-β1对肝细胞的生长调控至关重要. Bedossa et al[12]研究发现, 肝癌组织表达TGF-β1, 正常肝脏、肝硬化不表达TGF-β1; 正常肝细胞膜周可表达TGF-β1RII, 而肝癌组织细胞膜周不表达TGF-β1RII, 但部分肝癌细胞核周可见到TGF-β1RII聚集. 本研究结果显示, 在肝癌组织中TGF-β1表达增强, TGF-β1RII表达减弱, 而癌旁组织相反. 说明二者在肝癌发生中起重要作用. TGF-β1能抑制血管增殖, 促进肝细胞凋亡, 但由于肝癌组织TGF-βRII表达减弱, 使肝癌细胞逃逸了TGF-β1的抑制作用[13], 从而导致了肝癌的发生发展. 本研究结果还显示, 肝癌组织中TGF-β1 mRNA存在异常, 说明肝癌组织中TGF-β1基因存在多个水平异常. 且TGF-β1蛋白与TGF-β1 mRNA呈正相关, 由于蛋白表达的检测简单易行, 而原位杂交条件要求较高, 因此前者更适合广大医务工作者开展.

TGF-β1的合成受核转录因子的调控, 目前发现的核转录因子主要有NF-κB、AP-1等. NF-κB是1986年Sen和Baltimore应用凝胶电泳迁移率实验研究发现的B细胞核提取物中存在的一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子kB序列特异性结合的蛋白质因子, 他是由p65和p50组成的二聚体. 正常情况下他存在于胞质, 当受到刺激后, NF-κB的抑制因子IkB从NF-κB复合体上脱落, 活化的NF-κB进入细胞核促进靶基因转录. 由于TGF-β1活化因子组织转谷氨酰氨酶(tissue transglutaminase, tTG)基因的启动子中含有NF-κB的结合位点, 因而NF-κB能促进TGF-β1表达. 本研究结果证实NF-κB表达与TGF-β1表达呈正相关. 总之, 肝癌组织中TGF-β1基因的变化发生在多个水平, 肝癌细胞中TGF-β1、TGF-β1RⅡ、NF-κB蛋白表达异常, 并与MVD相关, 提示他们在肝细胞癌血管形成中可能发挥重要作用, NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用.

备注

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

参考文献

1.	Gressner AM, Weiskirchen R, Breitkopf K, Dooley S. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis. Front Biosci. 2002;7:d793-807.  [PubMed]  [DOI]

2.	Dennler S, Goumans MJ, ten Dijke P. Transforming growth factor beta signal transduction. J Leukoc Biol. 2002;71:731-740.  [PubMed]  [DOI]

3.	Zimmerman CM, Padgett RW. Transforming growth factor beta signaling mediators and modulators. Gene. 2000;249:17-30.  [PubMed]  [DOI]

4.	应 月强, 曹 晓智, 伍 先久, 李 希麟. 结直肠癌组织中转化生长因子b表达的意义. 世界华人消化杂志. 2004;12:2184-2185.  [PubMed]  [DOI]

5.	张 朋彬, 李 宜辉, 徐 采朴. 转化生长因子bII型受体在胃癌组织中表达的研究. 世界华人消化杂志. 2004;12:1531-1533.  [PubMed]  [DOI]

6.	Woszczyk D, Gola J, Jurzak M, Mazurek U, Mykala-Ciesla J, Wilczok T. Expression of TGF beta1 genes and their receptor types I, II, and III in low-and high-grade malignancy non-Hodgkin's lymphomas. Med Sci Monit. 2004;10:CR33-37.  [PubMed]  [DOI]

7.	Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathol. 1995;147:9-19.  [PubMed]  [DOI]

8.	Chen WX, Min PQ, Song B, Xiao BL, Liu Y, Ge YH. Single-level dynamic spiral CT of hepatocellular carcinoma: Correlation between imaging features and density of tumor microvessels. World J Gastroenterol. 2004;10:67-72.  [PubMed]  [DOI]

9.	Poon RT, Ng IO, Lau C, Yu WC, Yang ZF, Fan ST, Wong J. Tumor microvessel density as a predictor of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma: a prospective study. J Clin Oncol. 2002;20:1775-1785.  [PubMed]  [DOI]

10.	Lin JK, Chou CK. In vitro apoptosis in the human hepatoma cell line induced by transforming growth factor beta 1. Cancer Res. 1992;52:385-388.  [PubMed]  [DOI]

11.	Kim BC, Mamura M, Choi KS, Calabretta B, Kim SJ. Transforming growth factor beta 1 induces apoptosis through cleavage of BAD in a Smad3-dependent mechanism in FaO hepatoma cells. Mol Cell Biol. 2002;22:1369-1378.  [PubMed]  [DOI]

12.	Bedossa P, Peltier E, Terris B, Franco D, Poynard T. Transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta 1) and TGF-beta 1 receptors in normal, cirrhotic, and neoplastic human livers. Hepatology. 1995;21:760-766.  [PubMed]  [DOI]

13.	Ueno T, Hashimoto O, Kimura R, Torimura T, Kawaguchi T, Nakamura T, Sakata R, Koga H, Sata M. Relation of type II transforming growth factor-beta receptor to hepatic fibrosis and hepatocellular carcinoma. Int J Oncol. 2001;18:49-55.  [PubMed]  [DOI]