大鼠CCl4所致肝纤维化自发逆转的基因表达谱研究

摘要

目的: 利用cDNA微阵列杂交筛选肝纤维化自发逆转过程中的差异表达基因, 从而揭示纤维化逆转的基因表达谱.

方法: 通过四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl₄)注射SD大鼠8 wk, 随后停药6 wk建立肝纤维化自发逆转的动物模型.提取纤维化逆转过程中不同时间段的肝组织mRNA, 与cDNA微阵列杂交, 筛选表达水平明显上调或下调的差异基因, 并结合Cluster分析等进行分类.此外选择α共核蛋白、A-raf、早老素2及β 肌动蛋白作RT-PCR以验证检测结果.

结果: CCl₄诱导的肝纤维化在停止毒剂注射后出现进行性消退.cDNA微阵列杂交证实, 肝纤维化消退过程中共有254条基因出现转录水平改变, 占基因总数的21.59%.其中8, 10, 12, 14 wk的差异表达基因分别为54, 85, 97, 132条.筛选所得的肝纤维化逆转相关基因主要涉及代谢相关酶、脂肪代谢相关蛋白、离子通道、转录因子、胃肠激素及受体、MAPK及PI3k/Akt信号转导通路等.RT-PCR检测与cDNA微阵列杂交一致, 证实了结果的可靠性.

结论: 肝纤维化逆转过程中基因表达谱发生显著改变, 主要涉及代谢相关酶、转运蛋白/协同转运蛋白、胃肠激素及受体、脂蛋白/脂肪酸结合蛋白、转录因子/核因子、MAPK信号转导通路等6类基因.

关键词: 基因芯片; 肝纤维化; 逆转

Gene expression profile analysis of spontaneous reversion of CCl₄-induced hepatic fibrosis in rats

Qin Pan, Wei-Fen Xie, Zhong-Bing Zhang, Xin Zhang, Ze-Guang Han

Qin Pan, Wei-Fen Xie, Zhong-Bing Zhang, Department of Gastroenterology of Chang Zheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

Xin Zhang, Ze-Guang Han, Chinese National Human Genome Southern Center, Shanghai 201203, China

Supported by: Postdoctoral Science Foundation of China, No. 2004036325.

Correspondence to: Qin Pan, Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, 415 FengYang Road, Shanghai 200003, China. fangchunhua@online.sh.cn

Received: April 20, 2005
Revised: April 28, 2005
Accepted: May 6, 2005
Published online: July 15, 2005

Abstract

AIM: To screen the differentially expressed gene in the spontaneous reversion of hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl₄), and to reveal the gene expression profile in this process.

METHODS: Animal model of hepatic fibrosis with spontaneous reversion was created in SD rats by injection of carbon tetrachloride (CCl₄) for 8 weeks and then withdrawing for 6 weeks. The mRNA of liver tissues was extracted at different time spots in the process of reversion. Then cDNA microarray was used to screen the differentially expressed genes. Finally the products were subjected to hierarchical clustering and confirmed by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) of α-synuclein, A-raf, presenilin-2 and β-actin.

RESULTS: Hepatic fibrosis was progressively reversed after stopping injection of CCl₄. All together, there were 254 (21.59%) genes that changed at the transcription level. Meanwhile, 54, 85, 97 and 132 genes were identified differentially expressed in the 8^th, 10^th, 12^th and 14^th week, respectively. After confirmed by RT-PCR, the differentially expressed were associated with metabolic enzymes, ion channels, transcription factors, gastrointestinal hormones and their receptors, mitogen-activated protein kinase (MAPK) and PI3k/Akt signaling pathway.

CONCLUSION: The gene expression profile is significantly changed in the spontaneous recovery of CCl₄-induced hepatic fibrosis. Genes closely related to the spontaneous recovery are associated with metabolic enzymes, transporter/symporter proteins, gastrointestinal hormones/receptors, lipoprotein/fatty acid binding proteins, transcription factor/nuclear factors, and MAPK signal pathway.

Key Words: Gene Microarray; Hepatic fibrosis; Spontaneous reversion

0 引言

近年研究显示, 消除致病因素[1-3]或应用有效的抗纤维化药物[4-8]都能诱导肝纤维化发生逆转.然而纤维化的逆转过程十分复杂, 涉及众多基因[9-11], 目前的研究仅局限于单一因素分析, 难以全面揭示肝纤维化逆转中的基因表达状况.为此, 我们在建立大鼠纤维化自发逆转模型的基础上, 采用cDNA微阵列杂交快速、高通量地筛选纤维化逆转过程中的差异表达基因, 以期阐明纤维化自发逆转的相关基因表达谱, 总结纤维化逆转的确切机制.

1 材料和方法

1.1 材料

雄性Sprague-Dawely大鼠, 质量180-240 g(中国科学院上海实验动物中心); Oligotex mRNA Midi 试剂盒(Qiagen公司), 33P dATP(Life Sciences公司), Atlas Rat 1.2 cDNA芯片(BD公司); 杂交炉(Hybaid公司); phosphorimager扫描仪(Molecular Dynamics公司); Gene AMP PCR system 9700型PCR扩增仪.

1.2 方法

将Sprague-Dawely大鼠随机分为正常对照组(n = 5)及肝纤维化逆转模型组(n = 22).模型组大鼠SC 400 mL/L四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl₄)(6 mL/kg, 首剂加倍), 正常对照组则以同样方法注射等量橄榄油, 每3 d一次, 共8 wk, 此后停药6 wk.8, 10, 12, 14 wk末分别处死5只大鼠, 肝组织经HE及VG染色后进行纤维化程度的半定量评级[12]: S1, 汇管区、汇管区周围纤维化, 局限性窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕, 均不影响小叶的完整性; S2, 虽有纤维间隔即桥接纤维化形成, 但大部分小叶结构仍保留; S3, 大量纤维间隔形成, 分隔并破坏肝小叶, 导致小叶结构紊乱, 但尚无肝硬化; S4, 早期肝硬化, 可见肝实质广泛破坏, 弥漫性纤维增生, 被分隔的肝细胞团出现不同程度的再生及假小叶形成, 但纤维间隔宽大疏松, 改建尚不充分.取正常对照组及8, 10, 12, 14 wk肝纤维化逆转模型组大鼠的肝组织(0.8 g/只), 以酚/氯仿抽提5组总RNA, 分别混合后分离mRNA.采用变性mRNA(1 μg)与DTT, dNTP, M-MLV, ³³P dATP 于37℃共孵育1.5 h.所得探针经纯化后与鲑精 DNA 封闭的Atlas Rat 1.2大鼠cDNA微阵列在68℃条件下杂交12-18 h.随即顺序进行低严谨度及高严谨度洗膜、磷屏曝光、扫描.图像经均一化后, 以Array Vision 5.1软件分析, 筛选出表达水平上调或下调3倍的差异表达基因, 并应用Cluster 3.0及Treeview软件作Cluster分析.在cDNA微阵列检测结果中选择表达上调(α-共核蛋白、A-raf)、下调(早老素2)及保持稳定(β-肌动蛋白)的基因.按同样分组方法, 取肝组织总RNA(2 μg/组)、随机引物0.5 μg、MMLV 200 U于37℃逆转录1 h以生成cDNA.引物设计: (1)α-共核蛋白: 5'GGGTACCCA CAAGAGGGAAT3'(上游), 5'CGATCACTGCTGATGGAAGA3'(下游), 扩增片断长248 bp; (2)A-raf: 5'ACTCCAG CCTCATGCAGTTT 3'(上游), 5'TGTCGTGTCTTCCTG AGCAC3'(下游), 扩增片断长401 bp; (3)早老素2: 5'CTACCTCGGGGAAGTGTTCA3'(上游), 5'AGTGCGC TGATCACAATGAG3'(下游), 扩增片断长156 bp; (4)β-肌动蛋白(内参照): 5'ACCCACACTGTGCCCATCTATG 3'(上游), 5'AGAGTACTTGCGCTCAGGAGGA 3'(下游), 扩增片断长521 bp.反应体系: cDNA 3 μL, 上、下游引物各1 μL, Taq酶1 U, dNTP(2 mM)1 μL, MgCl2(25 mM)1.5 μL, 10×反应缓冲液2.5 μL, 加纯水至25 μL.优化反应条件: (1)α-共核蛋白: 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 共36个循环; (2)A-raf: 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 45 s, 共36个循环; (3)早老素2: 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共35个循环; (4)β-肌动蛋白: 94℃ 30 s, 54℃ 30 s, 72℃ 45 s, 共26个循环.另设不加逆转录酶, 或以蒸馏水为模板的阴性对照管, 与各样本管同期扩增.产物加入20 g/L琼脂糖凝胶, 以100 V恒压电泳60 min左右, 紫外透射仪下观察结果.

统计学处理 结果以mean±SD表示, 采用方差分析检验及t检验, 以SPSS软件处理.

2 结果

2.1 建立肝纤维化自发逆转模型

CCl₄ sc 8 wk后, 肝纤维化逆转模型组大鼠可见大量胶原沉积于小叶中央静脉、汇管区、肝窦间隙等部位, 并形成纤维间隔及假小叶.同时出现中央静脉扩大、肝细胞脂肪变性、炎性细胞浸润、肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化及增殖等肝纤维化的特征性改变.组织纤维化程度达S3-S4.正常对照组大鼠的肝组织则均属正常.停止毒剂注射后, 各类病理改变均逐渐减轻, 胶原纤维显著减少, 纤维间隔变少、变细.10-12 wk时纤维化逆转模型组的肝纤维化程度为S2-S3, 而第14 wk时仅为S1.通过检测cDNA微阵列上各点的nARVOL, 并采用9个阳性对照点及3个阴性对照点对数据进行均一化后, 共筛选出254条在肝纤维化逆转过程中表达显著上调或下调的差异基因, 约占基因总数的21.59%.其中8, 10, 12, 14 wk末的差异表达基因数分别达54条(22条上调, 32 条下调), 85条(52条上调, 33条下调), 97条(77条上调, 20条下调), 132条(44条上调, 88条下调).

分层Cluster分析则显示, 差异表达基因属两大基因簇.基因簇1包含65条基因, 主要有多种代谢相关酶, 尤其是细胞色素P450、细胞色素C氧化酶、谷胱甘肽S转移酶等(表1).此外, 还包括I型及IV型载脂蛋白A、1型及7型脂肪酸结合蛋白等脂肪代谢相关基因.此类基因在肝纤维化逆转过程中表达上调, 且峰值均出现于14 wk.

表1 基因簇1中的代谢相关酶.

基因	GenBank号	与正常对照组的比率
		8 wk	10 wk	12 wk	14 wk
细胞色素P450, IIC亚族	J02657	0.19	1.52	3.73	5.20
细胞色素P450, 2E1亚族	J02627	0.91	1.55	3.22	2.53
细胞色素P450, 2c39	M18335	0.33	0.33	0.64	2.37
细胞色素P450, 4F4	U39206	0.32	0.58	1.59	2.12
细胞色素P450, 3A1	M10161	0.24	1.64	2.08	2.23
细胞色素P450, 4A3	M33936	0.28	0.72	0.90	1.50
细胞色素P450, 4a10	M37828	1.52	3.44	3.64	3.10
细胞色素氧化酶, I亚单位	S79304	1.43	2.61	2.67	3.28
细胞色素C氧化酶, IVa亚单位	X14209	1.55	1.54	3.28	2.88
细胞色素C氧化酶, VIIa 3亚单位	X54080	0.32	0.37	2.31	3.03
细胞色素C氧化酶, Vb亚单位	D10952	0.94	1.40	2.61	3.21
μ型谷胱甘肽S转移酶	J02592	0.68	2.70	5.07	4.85
α型谷胱甘肽S转移酶	K01931	0.26	0.66	4.54	9.51
微粒体谷胱甘肽S转移酶1	J03752	0.29	0.57	0.74	3.36

基因簇2含有189条差异表达基因, 其中除已知的基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶抑制物[1-3,9,11]外, 既有钙、钾、钠、氢、氯等离子通道的编码基因, 也有水通道蛋白及氨基酸转运蛋白基因(表2).胃肠激素及其受体在基因簇2中也较丰富(表3).

表2 基因簇2中的膜通道蛋白.

基因	GenBank号	与正常对照组的比率
		8 wk	10 wk	12 wk	14 wk
内流型整流钾离子通道(J亚族)	L29403	1.06	1.34	3.21	0.87
内流型整流钾离子通道(J亚族, 5型)	L35771	1.15	2.92	3.15	0.87
蛋白激酶C调节氯离子通道	D17521	2.67	2.84	3.22	2.26
I型氯离子通道	X62894	1.06	1.46	3.05	0.74
感觉神经特异性阳离子通道	AF013598	0.40	0.42	0.34	0.27
钙离子通道(β3亚单位)	M88751	0.93	1.33	3.26	0.92
水通道蛋白1	X71069	1.14	2.46	4.14	1.06
水通道蛋白2	D13906	1.417	2.51	5.89	1.28
水通道蛋白3	D17695	1.62	2.46	3.26	2.81
水通道蛋白4	U14007	0.36	0.39	1.49	0.22
水通道蛋白5	U16245	0.58	0.69	2.05	0.26
溶质转运蛋白(6亚族, 3型)	M80570	1.30	1.47	3.04	1.34
溶质转运蛋白(9亚族)	M85299	1.12	5.60	0.87	0.64
溶质转运蛋白(12亚族, 1型)	U10096	0.36	0.44	0.95	0.29
溶质转运蛋白(12亚族, 3型)	U10097	0.40	0.68	0.95	0.27
溶质转运蛋白(17亚族, 1型)	U28504	1.14	1.58	3.67	1.56
溶质转运蛋白(17亚族, 2型)	L13257	1.29	1.54	3.32	1.49

表3 基因簇2中的胃肠激素及受体.

基因	GenBank号	与正常对照组的比率
		8 wk	10 wk	12 wk	14 wk
生长抑素	M25890	3.12	3.90	1.50	0.66
速激肽2	M16410	5.96	6.81	4.31	2.16
成纤维细胞生长因子10	D79215	13.61	18.10	11.38	9.60
神经生长因子受体	X05137	0.59	0.62	0.43	0.31
I型胰岛素样生长因子受体	L29232	0.59	0.60	0.58	0.33
IV型成纤维细胞生长因子受体	M91599	0.37	0.43	0.42	0.23
酪氨酸激酶受体2型配体	U97143	0.34	0.87	0.31	0.28
6型5羟色氨受体	L03202	3.75	5.54	2.78	1.45
2型雌激素受体 (ERβ)	U57439	0.89	1.12	3.30	0.34

此外, 基因簇2又可依据表达时序等特征分为2个亚簇.第2亚簇中转录因子及核因子较多, 如真核细胞启动因子5, Jun D原癌基因、c-fos原癌基因等.10 wk时c-fos原癌基因、Jun D原癌基因的转录水平分别达正常对照组的14.71及3.63倍.有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-OH kinase, PI3K)/Akt信号转导通路中的多个重要激酶, 如A-raf、有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶2(mitogen-activated protein kinase kinase 2, MAPKK2)、有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶5(mitogen-activated protein kinase kinase 5, MAPKK5)、有丝分裂原活化的蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3, MAPK3)、PI3K等也包含于第2亚簇中, 且在肝纤维化逆转的第8-14 wk表达高度上调.

A-raf及α共核蛋白的表达水平在肝纤维化自发消退的过程中显著升高, 并在10 wk时达到峰值.而早老素2则随肝纤维化的逆转出现表达水平显著降低, 尤其10 wk时最为明显.管家基因β肌动蛋白的转录水平在整个过程中基本保持稳定.半定量RT-PCR与cDNA微阵列检测相吻合, 由此证实所得结果具有较高的准确性和可信度.

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病向肝硬化进展的主要中间环节.近年Iredal et al[13]报道, 经腹腔注射CCl₄ 2次/wk, 共4 wk可诱发大鼠肝纤维化, 停止毒剂注射后28 d纤维化几乎完全消退.而由胆道梗阻及胆汁郁积导致的患者或大鼠肝纤维化经胆道再通后均出现逆转[14].多项研究也显示, 消除致病因素或者应用抗纤维化药物, 都可部分或完全逆转患者及模型动物中存在的肝纤维化.为此, 我们依据既往动物模型及相关报道[1-2,13], 首先采用CCl₄/橄榄油皮下注射诱导成年雄性SD大鼠发生肝纤维化, 随之停止毒剂接触促使纤维化自发恢复.结果显示, 经CCl₄注射8 wk后可见多项典型的肝纤维化病理改变, 如纤维间隔形成、中央静脉及肝窦周围纤维化、小叶结构紊乱、HSC增生、汇管区扩大等.而停药后10, 12, 14 wk末, 上述病理改变以及肝纤维化分期均出现进行性改善, 直至第14 wk时纤维化分期仅为S1.以此为基础, 通过收集肝纤维化逆转过程中不同时段的肝组织mRNA, 并与cDNA微阵列杂交, 共筛选得到254条差异表达基因, 约占微阵列中基因总数的21.59%.其中, 8, 10, 12, 14 wk时的差异基因数分别为54、85、97及132条.提示纤维化逆转时肝脏基因表达谱存在广泛改变, 并且随着纤维化的消退, 参与的基因也不断增多.通过分层Cluster可将差异表达基因分为2个基因簇及若干基因亚簇.综合分层Cluster、基因功能及表达时序分析, 在差异表达基因中共发现6类基因: (1)代谢相关酶, 包括基因簇1中的7型细胞色素P450同工酶、5型细胞色素氧化酶的同工酶、以及3型谷胱甘肽S转移酶的同工酶.其中绝大多数在肝纤维化逆转的早、中期(10-12 wk)表达水平明显上升.由于细胞色素P450的同工酶在胆汁淤积及CCl₄诱导的大鼠肝纤维化中表达水平显著降低[15], 在重度肝纤维化的患者中也大幅低于正常[16], 而谷胱甘肽S转移酶的同工酶在原发性胆汁性肝硬化患者中较少表达[17], 因此诸多代谢相关酶的表达上调可能是肝细胞代谢功能增强、肝功能逐渐恢复的表现[18-20].(2)载脂蛋白、脂肪酸结合蛋白等脂肪代谢相关蛋白的编码基因也出现于基因簇1中.由于相关的mRNA水平在肝纤维化逆转过程中均表现为上调, 且峰值均出现于14 wk, 而此时肝细胞内脂滴的数量较纤维化时明显减少, 因此脂肪代谢相关基因的高表达可能与加强脂肪代谢、减轻肝脏脂肪变性有关.(3)纤维化逆转时, 包括多种离子通道(钙、钾、钠、氢、氯离子通道)、谷氨酸盐通道、水通道及溶质转运蛋白在内的膜通道基因出现转录改变.此类基因的特点是均编码转运蛋白或协助转运蛋白, 并多在纤维化消退的中、后期(12, 14 wk)表达水平显著上调或下调.钙离子浓度及pH值的改变可影响细胞增殖能力, 因而对膜通道水平的调节可能在稳定细胞内环境、促进损伤修复及肝细胞增殖方面发挥重要作用.(4)真核细胞启动因子5、Jun D原癌基因、c-fos原癌基因等典型的转录因子及核因子同样被发现出现差异表达.其中c-fos原癌基因、Jun D原癌基因的转录水平在第10 wk时分别较正常对照组高13.7及2.6倍, 从而进一步证实肝纤维化逆转过程涉及大量基因的转录激活.(5)基因簇2中的生长抑素、成纤维细胞生长因子10、速激肽2等胃肠激素在肝纤维化消退的全过程中表达水平均显著增高.与之相反, 同期神经生长因子受体、胰岛素样生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、5羟色胺受体等多数胃肠激素受体的转录却出现下调.业已证实, 生长抑素、成纤维细胞生长因子、5羟色胺、IV型成纤维细胞生长因子受体、雌激素受体β、神经生长因子受体等均与肝纤维化的发生密切相关[5,21-24].胃肠激素及其受体的表达改变提示该类基因也可能参与肝纤维化的逆转过程.(6)MAPK及PI3K/Akt信号转导通路的关键激酶A-raf, MAPKK2, MAPKK5, MAPK3, PI3K在肝纤维化逆转的8-14 wk时表达高度上调.MAPK信号通路是主要的细胞生存通路, 对损伤修复、细胞增殖都具有重要意义[25-26], 该通路的持续激活可有效地保护肝细胞[27-30], 促进肝纤维化逆转.

通过对各类基因功能及表达特点的总结, 初步提示多种胃肠激素可能通过G蛋白耦联受体活化细胞内的MAPK信号通路, 并经由MAPK转位入核, 磷酸化c-fos、c-Jun等转录因子, 促使代谢相关酶、细胞膜通道等效应分子的表达提高, 改善细胞代谢功能, 恢复正常的内环境, 由此加速损伤修复及肝细胞增殖, 最终导致肝纤维化的逆转.这可能加深我们对肝纤维化逆转机制的认识, 并为确定合理的纤维化防治策略提供科学依据.

备注

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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