FLIP干扰性小RNA促进大肠癌细胞的凋亡

摘要

目的: 研究对应FLIP基因的siRNA片段对大肠癌细胞株HT-29凋亡的影响, 明确FLIP在Fas介导的凋亡途径中的作用.

方法: 体外培养大肠癌细胞HT-29, 通过电穿孔技术将特异性siRNA片段转染入细胞, 半定量RT-PCR法判断干扰前后FLIP mRNA水平的变化, 分析RNA干扰的特异性、时效性, 并比较对应不同位点的两个siRNA片段对FLIP的干扰效果.经凋亡诱导型抗体激活后, 以Annexin V染色法及DNA降解片段检测分析干扰前后HT-29细胞对Fas介导的凋亡敏感性的改变.

结果: 特异性siRNA片段能有效降低FLIP mRNA水平, 最大干扰效率达65.02%, 明显高于作为对照的非相关片段; 干扰作用于转染后24 h即可出现, 48 h达高峰, 72 h稍有降低; 对应不同位点的两个siRNA片段对FLIP均可产生干扰作用, 彼此间差别不大.在诱导型抗体的刺激下, 与未转染细胞相比, 转染siRNA的HT-29细胞中凋亡细胞所占比例明显增加.

结论: 特异性siRNA片段可显著降低FLIP基因mRNA的表达水平, 并提高HT-29细胞对Fas介导的凋亡敏感性.以FLIP为靶点的RNA干扰技术可望成为大肠癌基因治疗的新方法.

关键词: 大肠癌; FLIP; siRNA; 凋亡

Effect of FLIP small interfering RNA on apoptosis of colorectal cancer cells

Bao-Cun Sun, Feng-Lin Zang, Rui-Fang Niu, Xi-Yin Wei, Xiu-Lan Zhao, Shi-Wu Zhang

Bao-Cun Sun, Feng-Lin Zang, Rui-Fang Niu, Xi-Yin Wei, Shi-Wu Zhang, Institute of Oncology, Tianjin Medical University, Tianjin 300060, China

Xiu-Lan Zhao, Department of Pathology, Tianjin Medical University, Tianjin 300060, China

Supported by: the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 013611511.

Correspondence to: Bao-Cun Sun, Institute of Oncology, Tianjin Medical University, Huanhuxi Road, Tiyuan North, Hexi District, Tianjin 300060, China. baocunsun@eyou.com

Received: April 26, 2005
Revised: May 7, 2005
Accepted: May 14, 2005
Published online: July 15, 2005

Abstract

AIM: To investigate the promotion effect of small interfering RNA of FADD-like IL-1β converting enzyme inhibitory protein (FLIP) on the cell apoptosis in colorectal cancer.

METHODS: Human colorectal cancer cell line HT-29 was cultured in vitro and transfected with two siRNAs (different loci) of FLIP by electroporation technique. The level of FLIP mRNA expression before and after interfering was detected by semi-quantitative polymerase chain reaction (PCR). The specificity and time effect for interference and the interfering effect between the two siRNAs were compared. Then the cells were treated with agonistic anti-Fas antibody to induce apoptosis. The apoptosis before and after interfering was determined by Annexin V and DNA degration.

RESULTS: The level of FLIP mRNA in HT-29 cells was inhibited by the specific siRNAs. The decrease of FLIP mRNA expression began to appear 24 hours after transfection. And the most apparent interfering efficiency was 65.02% 48 hours after transfection, which was markedly higher than that in the cells transfected with the control siRNAs. Both siRNAs (siRNA-F1 and siRNA-F2) from different loci had interfering effect on FLIP mRNA expression, but there was no significant difference between them. Compared with those in non-transfected cells (1.76%), the apoptotic rates were significantly higher in siRNA transfected cells (29.50%) after treated with agonistic anti-Fas antibody.

CONCLUSION: Small interfering RNA of FLIP can markedly decrease the expression of FLIP mRNA and sensitize the Fas-mediated apoptosis of colorectal cancer cell line HT-29. The RNA interfering technique targeted on FLIP may provide a new method in the gene therapy of colorectal cancer.

Key Words: Colorectal cancer; FADD-like IL-1b converting enzyme inhibitory protein; Small interfering RNA; Apoptosis

0 引言

FLIP(FADD-like IL-1β converting enzyme inhibitory protein)是近年来发现的一类凋亡抑制蛋白.现已证实, FLIP的高表达与恶性黑色素瘤[1]、Burkitt淋巴瘤[2]、卡波氏肉瘤[3]等的发生、发展具有密切相关性.FLIP在蛋白水平上包括短型FLIP(FLIPS)和长型FLIP(FLIPL)2种形式, 前者只含有2个与caspase-8相似的死亡效应域(DED), 后者除此之外还含有一个caspase同源结构域, 但其中具有催化功能的半胱氨酸残基被酪氨酸残基所取代[4].因此, 虽然2种形式的蛋白均缺乏蛋白水解酶活性, 但FLIPL 与caspase-8在结构上似乎更为相近.本研究以大肠癌细胞为研究对象, 采用新近发现的RNA干扰技术, 将对应FLIPL的干扰性小RNA(small interfering RNA, siRNA)片段转染入细胞, 观察肿瘤细胞对Fas介导的凋亡敏感性的变化, 以期为肿瘤的基因治疗提供新的靶点和思路.

1 材料和方法

1.1 材料

siRNA片段: 对应FLIPL选用2对大小为20 nt的siRNA片段, 化学合成法制备, 由德国Stuggart大学Harald Wajant教授惠赠, 对应序列: siRNA-F1(FLIPL 472-492): 正义5'-ACAUUAGGUGGAACCACAUCU-3', 反义5'-AGAUGUGGUUCCACCUAAUGU-3'; siRNA-F2(FLIPL 908-928): 正义5'-GUAACUUGUCCCUGCUCCUUG-3', 反义5'-CAAGGAGCAGGGACAAGUUAC-3'[5].对应Ι型人类T细胞白血病病毒转录激活区(HTLV-1 Tax), 选用一条siRNA片段(siRNA-H), 由国家新药筛选中心李佳副研究员惠赠, 对应序列: 正义5'-GAUGGACGCGUUAUCGGCU-3', 反义5'-AGCCGAUAAC GCGUCCAUC-3'.经BLAST检索, 该片段与FLIPL之间不存在同源性, 故可作为非相关对照.主要试剂及仪器: Hypo-osmolar电穿孔缓冲液购自Eppendorf公司; ImProm-Ⅱ^TM反转录酶购自Promega公司, 其余RT-PCR试剂购自TaKaRa公司; 凋亡诱导型小鼠抗人Fas单抗(CH-11)、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自Beckman Coulter公司.电穿孔仪(Eppendorf Multiporator型), PCR仪(Perkin Elemer GeneAmp PCR System 9700型), 凝胶成像分析仪(Kodak 440CF型), 流式细胞仪(Beckman Coulter公司EPICS-XL型).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 大肠癌细胞株HT-29由天津肿瘤医院中心实验室保存, 常规培养在含100 mL/L胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L的RPMI1640培养基中, 培养条件为37℃、50 mL/L CO₂饱和湿度.

1.2.2 转染细胞: 取对数生长期的HT-29细胞, 胰酶消化, 重悬于含5 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中, 计数10⁶个细胞, 800 r/min离心, 以800 μL的Hypo-osmolar电穿孔缓冲液轻柔重悬, 室温静置25 min, 加入100 nmol/L的siRNA片段, 于500 V、70 μs条件下电穿孔(4 mm gap width电转杯).电转后室温静置5-10 min, 接种于6孔板(每个转染条件接种3个复孔), 每孔加入2.5 mL含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液, 37℃培养, 4 h后更换常规培养液, 继续培养.实验中, 以未经任何处理的细胞为对照, 并设仅施以电穿孔组和转染非相关片段(HTLV-1 Tax)组.

1.2.3 RT-PCR: 于转染后24、48、72 h, 收集细胞, PBS洗涤, 以TRIZOL试剂(Gibco公司)提取总RNA, 逆转录, 并进行PCR扩增(按试剂说明操作).FLIPL上游引物: 5'-ACCGAGACTACGACAGCTTTGTG-3', 下游引物: 5'-CAATGTGAAGATCCAGGAGTGGG-3', 扩增产物大小为429 bp[6]; 内参照β-actin上游引物: 5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3', 下游引物: 5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3', 扩增产物大小为318 bp.PCR反应条件为: 94℃预变性3 min; 94℃变性45 s, 65℃退火45 s, 72℃延伸2 min, 共35个循环, 最后72℃延伸7 min.扩增产物经13 g/L琼脂糖凝胶电泳, 并用Kodak 440凝胶成像系统进行灰度扫描密度分析, 计算目的基因的相对含量及干扰效率.目的基因相对含量(%) = 目的基因Net.Int./β-actin Net.Int.×100%; 干扰效率 = [未处理组FLIP相对含量(%)-处理组FLIP相对含量(%)]/未处理组FLIP相对含量(%)×100%.

1.2.4 凋亡检测: 以凋亡诱导型小鼠抗人Fas单抗(CH-11)刺激细胞, 37℃孵育16 h[6-7], 收集细胞, PBS洗涤2次.一方面, 取5×10⁵个细胞加入5 μL Annexin V-FITC溶液(5 mg/L)和2.5 μL的PI溶液(250 mg/L), 轻轻混匀, 冰上避光孵育10 min.另一方面, 取10⁶个细胞, 加入950 mL/L冷乙醇4℃过夜, 离心后加入含Rnase的PI染料(20 mg/L), 避光孵育30 min.2种不同方式处理后的细胞均经流式细胞仪检测, 计数凋亡细胞百分比.

1.2.5 重复性评价: 以上各种实验方法均独立进行3次以上.

2 结果

2.1 RNA干扰的特异性和时效性

以siRNA-F2为外源片段, 转染细胞, 半定量RT-PCR检测发现, 与未处理的细胞相比, 仅进行电穿孔和转染siRNA-H的细胞中, FLIPL mRNA含量无明显变化, 而转染siRNA-F2后, FLIPL mRNA含量明显下降(图1), 最大干扰效率达65.02%; 于转染后24 h, FLIPL mRNA的含量已出现下降, 最显著的干扰作用出现在转染后48 h, 72 h后FLIPL mRNA的表达水平略有回升(表1).

表1 半定量RT-PCR分析siRNA-F2对FLIPL mRNA的基因沉默.

条带		扩增基因	分子量(bp)	净密度	相对含量(%)	干扰效率(%)
未处理组	1	β-actin	319.4	7 381.73
	2	FLIPL	444.4 12	957.70	78.55
仅电穿孔组	3	β-actin	319.4	18 209.25
	4	FLIPL	430.6	13 073.23	71.79	8.61
siRNA-H	5	β-actin	319.4	17 978.57
	6	FLIPL	430.6	13 117.16	72.96 7.12
24 h组	7	β-actin	319.4	18 726.56
	8	FLIPL	430.6	9 492.42	50.69	35.47
48 h组	9	β-actin	305.6	20 367.85
	10	FLIPL	430.6	5 597.09	27.48	65.02
72 h组	11	β-actin	305.6	19 230.38
	12	FLIPL	416.7	6 146.03	31.96	59.31

图1 特异性siRNA片段使FLIPL mRNA含量降低. 1、2: 未处理细胞β-actin、FLIPL; 3、4: 仅电穿孔细胞β-actin、FLIPL; 5、6: 转染siRNA-H细胞β-actin、FLIPL; 7、8: 转染siRNA-F2 24 h后β-actin、FLIPL; 9、10: 转染siRNA-F2 48 h后β-actin、FLIPL; 11、12: 转染siRNA-F2 72 h后β-actin、FLIPL.

2.2 RNA干扰的靶向位点性

分别转染siRNA-F1、siRNA-F2以及二者的等量混合物, 收集转染48 h后的细胞, 进行半定量分析.结果发现, 转染3种不同类型的siRNA均可对FLIP产生干扰效果(图2); 相对而言, siRNA-F2的干扰作用(64.73%)略强于siRNA-F1(50.39%)以及二者的等量混合物(54.68%), 但彼此间差别不大(表2).

表2 RNA干扰的靶向位点性比较.

条带	siRNAs	扩增基因	分子量(bp)	净密度	相对含量(%)	干扰效率(%)
1	未处理组	β-actin	343.7	30 484.50
		FLIPL	437.5	23 768.76	77.97
2	siRNA-F1	β-actin	328.1	26 850.23
	(100 nmol/L)	FLIPL	437.5	10 385.67	38.68	50.39
3	siRNA-F2	β-actin	328.1	28 411.53
	(100 nmol/L)	FLIPL	453.1	7 813.17	27.50	64.73
4	F1(50 nmol/L)	β-actin	343.7	29 146.41
	+F2(50 nmol/L)	FLIPL	453.1	10 300.34	35.34	54.68

图2 对应不同位点的siRNA片段干扰效果比较. 1: 未处理细胞; 2: 转染siRNA-F1(100 nmol/L)细胞; 3: 转染siRNA-F2(100 nmol/L)细胞; 4: 转染F1(50 nmol/L)+F2(50 nmol/L)细胞.

2.3 HT-29细胞凋亡敏感性

2.3.1 AnnexinV染色法判断胞膜的改变: 与未处理的HT-29细胞相比, 转染siRNA-F2后细胞在各成分的组成上发生了明显的变化(图3).其中, 活细胞所占比例下降, 凋亡细胞和死细胞所占比例上升, 且凋亡细胞在细胞总体中所占的比例上升得尤为显著, 由1.76%升至29.5%(表3).

表3 转染siRNA-F2对HT-29细胞凋亡的影响.

细胞类型	活细胞(%)	凋亡细胞(%)	坏死细胞及碎屑(%)
未处理	96.7	1.76	0.35
转染siRNA-F2	63.5	29.50	5.04

图3 RNA干扰对大肠癌细胞HT-29凋亡的作用(Annexin V分析). A: 未处理细胞; B: 转染siRNA-F2细胞.左下象限代表活细胞, 右上象限代表坏死细胞及细胞碎屑, 右下象限代表凋亡细胞.

2.3.2 DNA降解片段: 转染siRNA后的细胞在G0/G1期前, 出现了明显的亚二倍体峰, 经软件分析确认其为凋亡峰; 未处理组中虽也存在一凋亡峰, 但峰值显然很低(图4).

图4 RNA干扰前后, 细胞DNA降解片段分析. A: 未处理细胞; B: 转染siRNA-F2细胞.

3 讨论

FLIP作为新近发现的凋亡相关因子, 由于其与caspase-8在结构上具有相似性, 故可竞争性与Fas相关死亡结构域(FADD)结合, 阻断caspase蛋白酶级联反应, 从而抑制Fas、TNFR-1、DR5、TRAILR等死亡受体介导的凋亡.到目前为止, FLIP对大肠癌的凋亡抑制作用尚未见报道.在本研究中, 我们采用RNA干扰技术, 将对应FLIPL的siRNA片段转染入大肠癌细胞株HT-29, 在mRNA水平上封闭其表达, 从而推测大肠癌中FLIPL在Fas介导的凋亡途径上起重要作用.RNA干扰是由双链RNA始动的、序列特异性转录后基因沉默现象, 主要通过双链RNA被核酸酶切割成约21-25 nt大小的RNA双链复合物, 即siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现[8].研究发现, 转染对应FLIPL的siRNA片段可特异性降低目的基因的mRNA水平, 而转染非同源的、对应HTLV-1 Tax的siRNA-H却几乎不产生任何干扰作用, 充分证实了RNA干扰的高度特异性.此外, 对应某一基因可能设计出许多对siRNA, 但并非所有的片段都能产生高效的沉默作用.因此, 设计、选择最佳的siRNA片段已成为RNA干扰研究的关键点之一.在目前的RNA干扰实验中, 常需设计3-5对不同的siRNA片段, 逐一实验以确定最有效的封闭位点.在本实验中, 转染100 nmol/L的siRNA-F1、siRNA-F2 48 h后, 干扰效率分别为50.39%和64.73%, 这提示对应这2个不同位点的siRNA片段均具有一定强度的基因沉默功能.Abedini et al[9]将对应另外4个不同位点的siRNA片段转染入人类卵巢癌细胞株, 也达到了较好的封阻效果.但这种封阻能力的相接近性是否与细胞类型、FLIPL表达水平等因素有关, 还有待于进一步探讨.

siRNA封阻FLIPL mRNA表达后, 以凋亡诱导型抗体激活细胞, 通过检测凋亡早期细胞膜表面磷脂酰丝氨酸的变化, 并结合DNA降解片段分析, 发现RNA干扰组的细胞对Fas介导的凋亡敏感性明显上升, 从反向基因功能研究的角度证实在大肠癌细胞中FLIP对Fas介导的凋亡受体通路起到了阻断作用.目前, 对于这种阻抑作用的机制仍未得到清晰的阐释.比较公认的观点是: FLIP主要通过阻断凋亡途径中的关键因子-caspase-8的剪切和活化, 起到抑制凋亡的作用.进一步研究发现, caspase-8的活化由连续的两步酶切水解作用完成: 第一步反应依靠分子内部的蛋白酶即可完成, 但需要来自另一分子的caspase样区域作为其补足集团, 该集团可以来自具有催化活性的caspase-8, 也可以来自无催化活性的FLIPL; 第二步反应则通过分子间的相互作用才能完成, 此时作为补足集团的caspase区域必须具有活性.因而当FLIPL过表达时, 胞质中可检测到第一步酶切产物caspase-8的p10亚基和FLIPL的p12亚基, 而检测不到caspase-8的第二步酶切产物p18亚基, 无法形成完整的caspase-8活性形式, 从而阻断了后续的蛋白酶级联反应[10].

本研究将特异性siRNA片段转染入肿瘤细胞, 为大肠癌细胞中存在RNA干扰现象提供了实验依据; 更重要的是, 封闭FLIP的表达后, 可显著提高大肠癌细胞对Fas介导的凋亡敏感性, 提示以FLIP为靶点的RNA干扰技术可望成为肿瘤基因治疗的新途径.

志谢

感谢Harald Wajant教授(University of Stuggart, Stuggart, Germany)和李佳副研究员(国家新药筛选中心, 上海, 中国)为本研究提供所需的特异性siRNAs片段.

备注

编辑: 王谨晖 审读: 张海宁

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