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世界华人消化杂志. 2005-06-15; 13(11): 1291-1294
在线出版日期: 2005-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i11.1291
荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法在临床的应用评价
张淑云, 刘伟, 李迪, 谷鸿喜, 仰曙芬, 周志红, 杜博, 金茜, 常曼丽
张淑云, 刘伟, 仰曙芬, 周志红, 杜博, 金茜, 常曼丽, 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 黑龙江省哈尔滨市 150086
李迪, 谷鸿喜, 哈尔滨医科大学微生物学教研室 黑龙江省哈尔滨市 150086
张淑云, 女, 1965-11-05生, 黑龙江省哈尔滨市人, 汉族. 1988年哈尔滨医科大学本科毕业, 1993年哈尔滨医科大学硕士毕业, 副主任医师, 副教授, 主要从事临床病毒学研究和临床基因诊断工作.
基金项目: 黑龙江省自然科学基金资助项目, No. D0307.
通讯作者: 张淑云, 150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路247号, 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心. zhshuyun136@sina.com
电话: 013163682992 传真: 0451-86688011
收稿日期: 2005-03-01
修回日期: 2005-03-27
接受日期: 2005-04-01
在线出版日期: 2005-06-15

目的: 对国产荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH-PCR-MC)检测乙型肝炎病毒聚合酶酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸基序(HBV YMDD)变异的试剂进行临床应用评价.

方法: 慢性乙型肝炎患者外周血浆标本217份, 分别采用荧光标记Taqman探针定量PCR法(FT-PCR)和荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH-PCR-MC)检测HBV DNA含量和YMDD及其变异; 其中78份HBV DNA阳性标本采用基因型特异性多引物对巢式PCR法进行基因分型(A-F), 30份标本用PCR产物克隆测序法检测HBV YMDD及其变异.

结果: 血浆标本HBV DNA阳性率(≥1.0×106 copies/L)为75.6%(164/217).YMDD及其变异检出率为67.7%(147/217), 其中YMDD 44.9%(66/147), YIDD 22.5%(33/147), YVDD 17.7%(26/147), YIDD/YVDD混合株10.9%(16/147), 其他混合株4.0%(6/147); 结合HBV DNA含量, HBV YMDD及其变异的检出下限为HBV DNA = 5.0×106 copies/L, 但在106 copies/L时检出率较低, 仅为36.4%, 随着HBV DNA含量增高, 检出率显著增高(>80%), 且在107 copies/L时即有显著增高(χ2 = 7.177, P <0.01).在基因分型的78份标本中, C基因型占89.8%, B和D基因型分别占8.9%和1.3%, YMDD及其变异总检出率为100%,变异总检出率为59.0%; 1份D基因型YMDD及其变异检测为YIDD/YVDD混合变异; B, C两种基因型变异检出率分别为71.4%和55.7%, 但二者无统计学差异.以测序法的检测结果为相对标准,则FH-PCR-MC法检测HBV YMDD及其变异的相对敏感性、特异性和符合率分别为96.3%(26/27), 100%(3/3)和96.7%(29/30); 对于HBV YMDD及其变异的类型, 两种方法检测结果一致.

结论: FH-PCR-MC法是一种快速、特异的HBV YMDD及其变异检测方法, 具有较高的检出率, 且能区分YMDD及其变异的类型.

关键词: 荧光标记; 杂交双探针; 多聚酶连反应; 融解曲线法; 乙型肝炎病毒YMDD
引文著录: 张淑云, 刘伟, 李迪, 谷鸿喜, 仰曙芬, 周志红, 杜博, 金茜, 常曼丽. 荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法在临床的应用评价. 世界华人消化杂志 2005; 13(11): 1291-1294
Evaluation of fluorescent hybridization biprobe PCR and melting curve assay
Shu-Yun Zhang, Wei Liu, Di Li, Hong-Xi Gu, Shu-Fen Yang, Zhi-Hong Zhou, Bo Du, Xi Jin, Man-Li Chang
Shu-Yun Zhang, Wei Liu, Shu-Fen Yang, Zhi-Hong Zhou, Bo Du, Xi Jin, Man-Li Chang, Research Center of the Second Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Di Li, Hong-Xi Gu, Department of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Supported by: the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. D0307.
Correspondence to: Shu-Yun Zhang, Research Center of the Second Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China. zhshuyun136@sina.com
Received: March 1, 2005
Revised: March 27, 2005
Accepted: April 1, 2005
Published online: June 15, 2005

AIM: To evaluate a fluorescent hybridization biprobe PCR and melting curve assay for detection of (hepatitis B virus) YMDD mutation associated with lamivudine therapy.

METHODS: HBV DNA and YMDD mutations in the 217 clinical serum specimens from patients with chronic HBV infection who were treated with lamivudine (100 mg/d) were detected by the fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) using TaqMan probe (FT-PCR) and the fluorescent hybridization biprobe PCR and melting curve assay (FH-PCR-MC), respectively. Seventy-eight positive sera were then genotyped by nested PCR with six pairs of HBV genotype-specific primes (A to F), and the cloned DNA fragments derived from conventional PCR of HBV YMDD of 30 positive sera were sequenced.

RESULTS: Among 217 samples, 75.6%(164/217) were HBV DNA positive, and 67.7% (147/217) were HBV YMDD positive, including YMDD 44.9%(66/147), YIDD 22.5%(33/147),YVDD 17.7%(26/147),YI/VDD 10.9%(16/147), and others 4.0%(6/147). In HBV DNA≥107copies/L, all the positive and mutant rates of YMDD have no significant difference in different HBV DNA levels. Among 78 genotype samples (genotype C 89.8%, B 8.9% and D 1.3%), the positive and mutant rates of YMDD were 100%(78/78) and 58.97%(46/78) respectively. One genotype D was YIDD/YVDD. The mutant rates of YMDD in genotype B and C were 71.4% and 55.7% respectively, but have no marked difference (P >0.5). Using the results by DNA sequencing as reference standard, the relative specificity, sensitivity and over-all accordance of FH-PCR-MC were 96.3% (26/27), 100% (3/3) and 96.7% (29/30) respectively. The results of YMDD typing by FH-PCR-MC were confirmed by the sequencing of clones.

CONCLUSION: The fluorescent hybridization biprobe PCR and melting curve assay kit in detection of HBV YMDD mutation has high sensitivity and specificity. It is a convenient and rapid test kit, and may be used in YMDD genotyping.

Key Words: Fluorescent hybridization biprobe PCR; Melting curve assay; HBV YMDD
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)可引起隐性感染、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列疾病的发生[1-2].拉米夫定是目前较为有效的抗HBV药物, 但临床应用中不断有病毒对治疗无反应, 或长期用药后出现病毒含量升高和转氨酶异常等现象, 即存在或发生了拉米夫定耐药[2-3].研究发现拉米夫定耐药是由于HBV P基因区的变异所致, 在HBV基因序列上主要表现为739位A→G或741位G→T, 在HBV聚合酶上表现为酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)基序改变, 即第522位蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)所取代, 形成M552V(YVDD)与M552I(YIDD)变异株[2-8].所以可应用HBV YMDD及其变异检测监控拉米夫定的疗效.目前常用的检测方法有基因克隆测序、限制性片断长度多态性分析(RFLP)、融解曲线法等[7-14].他们均应用PCR反应产物, 但克隆测序和RFLP较繁琐, 而且RFLP不能进行变异分型, 融解曲线法则是在荧光PCR后由仪器按程序自动完成, 无需PCR产物后处理, 简单、快速、防污染.我们用国产荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH-PCR-MC)检测YMDD及其变异的试剂对217份经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者外周血浆标本进行检测, 并以部分标本的PCR产物克隆测序结果为参比, 对该方法进行临床应用评价.

1 材料和方法
1.1 材料

2003-03/2004-10慢性乙型肝炎患者外周血(EDTA抗凝)217份, 男177份, 女40份, 年龄13-63(平均39)岁, 诊断符合第10次全国病毒性肝炎及肝病学术会议讨论修订的诊断标准[15].所有患者均口服拉米夫定(100 mg/d)进行治疗, 时间为8-40 mo.乙肝病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测(FT-PCR)试剂盒(灵敏度为5.0×105 copies/L)和HBV YMDD突变核酸扩增(PCR)荧光检测(FH-PCR-MC)试剂盒, 均购于深圳匹基生物工程有限公司; 基因分型、常规PCR、和测序引物由北京赛百盛公司合成, 其他试剂均购于Promega公司.仪器主要使用罗氏公司LightCycler荧光定量PCR仪、Bio-Rad基因扩增仪、Beckmen低温高速离心机天能凝胶成像分析仪等.

1.2 方法

HBV DNA的提取、定量和FH-PCR-MC法的YMDD及其变异检测和结果分析均按相应试剂盒说明进行.HBV DNA基因分型(A-F)按文献[16-17]提供的方法进行引物设计和基因分型操作; HBV YMDD基序区常规PCR和克隆测序参照文献[13].

统计学处理 数据处理采用SPSS10.0统计软件完成, 率的比较用χ2检验.

2 结果

FT-PCR定量检测HBV DNA, 阳性率(≥1.0×106copies/L)为75.6%(164/217).FH-PCR-MC法检测YMDD及其变异, 检出率为67.7%(147/217), 其中YMDD 44.9%(66/147), YIDD 22.5%(33/147), YVDD 17.7%(26/147), YIDD/YVDD混合变异10.9%(16/147), 其他混合变异4.0%(6/147).结合HBV DNA含量, HBV YMDD及其变异的检出下限为HBV DNA≥5.0×106 copies/L, 但在106 copies/L时检出率较低, 仅为36.4%; 随着HBV DNA含量增高, 检出率明显增高(>80%), 且在107 copies/L时即有明显增高(χ2 = 7.177, P<0.01, 表1).基因分型的78份标本中, 共分出C, B和D三种基因型, 分别占89.8%、8.9%和1.3, C基因型占优势; YMDD及其变异总检出率为100%, 变异检出率为59.0%; 1份D型为YIDD/YVDD混合变异; B, C两种基因型的YMDD及其变异分布和变异检出率见表2, 两种基因型变异检出率经统计学处理无显著差异(表2).

表1 217份血浆标本HBV DNA和YMDD及其变异检出结果.
HBV DNA(copies/L)nYMDD变异类型
阴性YMDD及其变异检出率(%)变异检出率(%)
YIDDYVDDYIDD/YVDD其他
≥10106128118103198.4(60/61)53.3(60/61)
109481910863295.8(46/48)58.7(27/46)
10825966484.0(21/25)57.1(12/21)
10719754384.2(16/19)56.3(9/16)
1061131736.4(4/11)25.0(1/4)
<106535300
合计2176633261667067.7(147/217)55.1(81/147)
表2 B、C两种基因型的YMDD及其变异分布和变异检出率.
基因型nYMDD变异类型
变异检出率(%)
YIDDYVDDYIDD/YVDD其他
B72211171.4
C703117145355.7

用FH-PCR-MC法和PCR产物克隆测序法, 同时检测30份HBV DNA阳性标本, 其中1份标本(HBV DNA 2.1×108 copies/L)基因分型和FH-PCR-MC检测结果均阴性, 但测序法检测为YMDD和YVDD混合株.其他29份标本两种方法检测的结果均相符, 分别为YMDD 7份、YIDD 9份、YVDD 4分、YIDD/YVDD 5份和YIDD/YMDD 1份.如以测序法的检测结果为相对标准, 则FH-PCR-MC法检测HBV YMDD及其变异的相对敏感性、特异性和符合率分别为96.3%(26/27)、100%(3/3)和96.7%(29/30)(表3).

表3 两种方法检测HBV YMDD及其变异的结果比较.
测序法nFH-PCR-MC法
阳性阴性
阳性27261
阴性303
合计30264
3 讨论

FH-PCR-MC法是基于LightCyclerTM杂交双探针技术和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer FRET)原理, 再结合融解曲线分析的一种突变检测法[10-13].即杂交双探针荧光(定量)PCR完成后, 以恒定的变温速率缓慢地升高扩增产物的温度, 可测定PCR产物的解链温度(又称融解温度 Tm值).由于探针的设计是横跨预计的突变位点的, 在低温时, 探针与所有的DNA模板进行杂交, 信号量达到最大; 当温度缓慢升高时, 由于单个碱基的不同造成结合能力的不同, 最终表现为野毒株和变异株的解链温度不同.在此过程中仪器连续进行荧光信号监控, 可得到每一份标本的融解曲线图及Tm值, 与YMDD及其变异的标准质粒进行比较可以完全地区分YMDD及其变异类型, 从而达到突变检测及分型的目的, 此过程由仪器按照设定的程序自动完成, 仅需10 min.深圳匹基生物工程有限公司根据该原理开发的国产试剂盒, 标准质粒融解曲线图及Tm值见图1∶YVDD Tm值最高, 为(60.0±1.5)℃; 其次为野生型YMDD, 为(50.0±1.5)℃; 而YIDD Tm值最低, 为(42.5±1.5)℃.所以, FH-PCR-MC法具有简单、快速、直观, 且能最大限度防止PCR产物污染等优点.

图1
图1 YMDD及其变异标准质粒融解曲线图(Tm值).

国外有报道杂交双探针荧光定量PCR的敏感性2.0×105 copies/L[18-19], 与我们用的FT-PCR法检测HBV DNA的国产试剂一致.FH-PCR-MC法首先是通过杂交双探针荧光(定量)PCR对标本HBV DNA进行定性(定量), 再对阳性标本进行融解曲线分析.我们的临床应用结果表明, 该国产试剂的敏感性略低(5.0×106 copies/L), 分析原因可能与选择的扩增区域不同、检测的人群不同等有关, 其临床意义尚需进一步探讨, 他检测的阳性标本均可进行YMDD及其变异分型, 且无基因型差异.

通过部分标本的PCR产物克隆测序结果验证, 该方法的特异性和YMDD及其变异分型的准确性均较好, 相对敏感性略低.但该方法较测序法简便、易行和省时、省力, 且可多个样本同时检测, 更易于临床应用.另为国内外学者常用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测拉米夫定的相关变异[9-20], 国内也有PCR-ELISA法[21-22]的报道, 但二者操作步骤均相对繁琐(有PCR产物后处理), 而且只能检测有无变异, 不能检测变异类型.

总之, FH-PCR-MC法融合了PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确度等优点, 直接检测PCR产物, 实行单管、闭管操作, 并能实时监测PCR后解链过程中荧光信号的变化, 操作简便快速, 结果直观明确.该方法不仅能准确、特异地检测YMDD及其变异, 而且能区分野生型、不同变异类型和混合型, 是一种较好的HBV YMDD及其变异检测方法.

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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