大鼠胚胎胰腺外分泌功能基因的表达调控

摘要

目的: 探讨大鼠胚胎胰腺发育外分泌功能基因表达调控.

方法: 采用高密度寡核苷酸芯片(Affemetrix芯片)对E15.5和E18.5胚胎胰腺进行基因转录水平分析, 基于获得的基因表达信息对UCSC, TRANSFAC, NCBI等公共数据库进行检索.

结果: 在差异或特异表达的1 319个基因中与胰腺细胞分化相关的转录因子和信号分子表达均下调, 但胰腺外分泌部特有的转录因子PTF1-P48, Mist1表达显著上调, 多种消化性酶表达亦显著增强, 然而与分泌功能相关的VAMP-2却无表达.

结论: 从E15.5至E18.5大鼠胚胎胰腺外分泌部积极地完善其消化功能, 但尚不能分泌多种消化性酶.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: July 14, 2004
Revised: July 25, 2004
Accepted: July 31, 2004
Published online: August 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

胰腺内外分泌部来源于共同的前体细胞-内胚层上皮细胞[1], 近年来内分泌部发育进程研究及转录因子在其中的调控作用倍受关注, 2004年Melto et al[2]以基因芯片技术建立了胰岛分化相关转录因子表达谱, 但外分泌部发育及其转录调控机制的研究进展却尚处于初期. 大鼠胚胎胰腺外分泌细胞标志物淀粉酶在E14.0开始表达, 在E15.5-E18.5腺泡结构渐清晰[1], 但此时外分泌部是否具备消化功能尚未明确. PTF1-P48和Mist1是目前已发现的胰腺外分泌部特异表达的极少数转录因子之一, 二者均属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族, 其在生理状态下胚胎胰腺外分泌部发育中的作用尚未见报道. 基因芯片技术已得到广泛应用[3-4], 但尚未见该项技术被应用于研究外分泌胰腺的发育问题. 2003年Davidson et al[5]提出基因调控网络的观点, 故我们采用基因芯片技术来探讨大鼠胚胎胰腺外分泌部在E15.5-E18.5功能完善进程及Mist1, PTF1-P48在其中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

成年SD大鼠30只, ♀20只, ♂10只, 于18: 00时, 将雌雄以1: 2合笼, 次日检测有阴栓者, 定为受精0.5 d(E0.5). 取E15.5, 18.5母鼠, 引颈处死, 分离出胚胎, 显微解剖镜下用显微镊子取出胰腺后, 迅速在液氮中冷冻. 用Trizol Reagent(美国Gibcobrl公司)提取大鼠E15.5, E18.5胰腺总RNA, 利用美国Qiagen公司生产的RNeasy Mini Kit纯化总RNA.

1.2 方法

以15 μg总RNA为模板合成双链cDNA, 采用BioArrayTM High YieldTM RNA Transcript Labeling Kit体外转录生成生物素标记的cRNA; 再经纯化和片段化处理后, 取30 μg cRNA与GeneChip Murine Genome RAE230A芯片(Affymetrix公司)杂交. 洗脱后, 用链酶亲和素－藻红蛋白进行染色扫描检测信号. 在微阵列分析软件(the Microarray Suite Software version 5.0)上进行数据分析. 对样品的表达结果采用线性度量(scaling)的方法在样品间进行校准.

2 结果

相对于E15.5, E18.5胰腺表达上调2倍以上的基因有664个, 其中特异表达的基因有207个, E18.5胰腺表达下调2倍以上的基因有655个, 其中特异表达的基因有182个(图1).

图1 X轴: E15. 5胰腺mRNA表达水平, Y轴: E18.5胰腺mRNA表达水平. 每一个点代表一个基因的表达水平: 红色的点表示该基因在E15.5 和 E18.5均有表达; 黄色的点表示该基因在E15.5 和 E18.5均无表达; 兰色的点表示该基因在E15.5有表达, E18.5无表达, 或者在E18.5有表达, E15.5无表达. P: 有表达, A: 无表达, M: 临界值.

2.1 外分泌部特异基因表达

胰腺外分泌部所特有的多种消化性酶如淀粉酶, 弹性蛋白酶, 胰糜蛋白酶, 羧肽酶表达均显著上调, 1, 4, 5-三磷酸肌醇受体3(IP3R3), 水通道8(Aquaporin 8)及胆囊收缩素受体(CCKAR)亦表达上升(表1). 胰腺外分泌部由腺泡和导管组成, 腺泡合成并分泌至少22种消化性酶, 其细胞内刺激分泌偶联机制为: 促分泌原如胆囊收缩素(CCK), 胃泌素等结合G蛋白偶联的受体(如CCKAR), 激活磷脂酶C, 产生第二信使IP3, 在IP3R3介导下内质网释放Ca²⁺, 胞内[Ca²⁺]的升高引起酶原颗粒移动, 在VAMP2[7]介导下入坞(docking), 最终胞吐[6,8]. 无活性的酶原通过导管进入肠道后被激活, 消化糖, 蛋白, 脂肪三大物质. 此外水通道8特异表达于腺泡细胞, 与胰液分泌紧密相关[9]. 本结果表明从E15.5至E18.5大鼠胚胎胰腺外分泌部进入功能完善活跃时期.

表1 E15.5-E18.5胰腺外分泌功能相关基因差异表达谱.

探针号	GenBank号	相关功能	差异(18.5/15.5)
1369787_at	NM_012688	Cholecystokinin A receptor (Cckar)	14.93↑P/A
1387700_at
1368005_at	NM_013138	Inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor 3 (IP3R3)	1.52↑P/P
1368316_at	NM_019158	Aquaporin 8	45.25↑P/A
1371160_at	AJ133104	Vesicle-associated membrane protein 2 (VAMP-2)	A/A
1387819_at	NM_012552	Elastase 1	4.59↑P/P
1387471_at	NM_012553	Elastase 2(Ela2)	22.63↑P/A
1369951_at	NM_012536	Chymotrypsin B (Ctrb1)	21.11↑P/P
1369030_at	NM_012635	Pancreatic trypsin 1	4.29↑P/P
1370126_at	NM_012729	Pancreatic trypsin II (Prss2)	68.59↑P/A
1368532_at	NM_032081	Pancreatic lipase related protein 1	5.28↑P/P
1369701_at	NM_012597	Lipase (Lipc)	2.64↑P/P
1370084_at	NM_012533	Carboxypeptidase B (Cpb)	4.29↑P/A
1369657_at	NM_016998	Carboxypeptidase A1 (Cpa1)	1.87↑P/P
1387503_at	NM_053526	Carboxypeptidase N (Cpn1)	2.64↑P/P
1369206_at	NM_05361	Carboxypeptidase B2 (plasma) (Cpb2)	3.73↑P/A
1368196_at	NM_013139	Colipase pancreatic (Clps)	21.11↑P/P
1370831_at	AY081195	Monoglyceride lipase	3.48↑P/A
1369502_a_at	NM_031502	Amylase 1	2.14↑P/P

↑: 从E15.5到E18.5表达上升, ↓: 从E15.5到E18.5表达下降, P: 有表达, A: 无表达.

2.2 PTF1-P48及Mist1表达趋势

相对于E15.5, PTF1-P48在E18.5表达上升5.28倍, Mist1表达上升7.46倍.PTF1-P48和Mist1均为胰腺外分泌部特异表达的基因, PTF1-P48启动多种消化性酶的表达, Mist1对维持腺泡的结构极其重要[6,10], 本结果表明从E15.5至E18.5 PTF1-P48和Mist1在启动胰腺外分泌部进入功能完善活跃时期中起了重要作用.

2.3 转录因子及相关信号分子表达趋势

从E15.5至E18.5与细胞分化相关的转录因子和信号分子表达均下降(表2), 此阶段胰腺细胞分化下调.

表2 E15.5-E18.5胰腺发育相关转录因子及相关信号分子差异表达谱.

	探针号	GeneBank号	名称及相关功能	差异倍数(18.5/15.5)
bHLH	1387212_at	NM_012863	Muscle, intestine and stomachexpression 1(mist1)	7.46↑P/p
	1369803_at	NM_053964	Pancreas specific transcriptionfactor, 1a (Ptf1a) or Ptf1-P48	5.28↑P/p
ZF domain	1387894_at	L22761	GATA binding protein 4 (Gata4)	2↑P/p
	1368510_at	NM_012764	GATA binding protein 1(Gata1)	3.48↑P/p
	1368827_at	NM_019185.1	GATA-binding protein 6 (Gata6)	2.14↑P/p
HD	1369681_at	NM_017339	ISL1 transcription factor,LIM / homeodomain 1(Isl1)	2.64↑P/A
	1369516_at	NM_022852	Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 (Pdx1)	1.74↑P/A
	1368873_at	NM_012581	Hoxa2	2.30↑P/p
	1388197_at	AA900970	Hoxa4	3.48↑P/A
	1370969_at	BE107303	Hoxa5	3.48↑P/P
Others	1371034_at	NM_022671	Hepatocyte nuclear factor 6	1.87↑P/p
	1368998_at	NM_031737	NK homeobox (Drosophila),family 6, A (NKX6.1)	2.14↓P/p

↑: 从E15.5到E18.5表达上升, ↓: 从E15.5到E18.5表达下降, P: 有表达, A: 无表达.

3 讨论

转录因子及相关信号分子在启动基因表达, 调控细胞分化中的作用已得到共识. Gata家族有6个成员, Gata4, 5, 6在内胚层细胞分化中起关键作用[11-18]. Gata6-/-小鼠内胚层分化缺陷[12]. ISL1胚胎早期表达于背胰间充质细胞, 为胰腺分化所必需[18]. Pdx-1特异表达于胰腺胚芽, Pdx-1-/-小鼠胰腺缺如[17], Hnf6-/-小鼠胚胎期表达Pdx-1的内胚层细胞显著减少, 胰腺发育不全[13], Nkx6.1是胰腺β细胞分化的关键因子[14], 在本实验中Gata6, ISL1, Hnf6, Pdx-1, Nkx6.1表达均显著下调. 由此可见, 在E15.5-E18.5与细胞分化相关的转录因子和信号分子表达显著下降, 胰腺细胞分化下调. 此外Hox家族与消化系统发育紧密相关, 过表达Hoxa4的小鼠发生巨结肠, Hoxa5胚胎期通过间充质-上皮间信号传导调控呼吸系统和消化系统发育[15], Hoxa2, 4, 5在本实验中表达趋势一致, 三者在胚胎胰腺发育尤其是功能完善中的作用是我们下一步要研究的问题.

本实验中转录因子PTF1-P48, Mist1 在E15.5-E 18.5表达上调, 各种消化性酶开始表达或表达上升, 受调分泌信号通路中关键因子CCKAR, IP3R3亦表达上升. PTF1-P48特异表达于胰腺腺泡, 与其他bHLH成员形成异三聚体启动多种消化性酶基因的表达[6], PTF1-P48-/-小鼠胰腺外分泌部缺如[10]. Mist1则特异分布于浆液性和浆液黏液性腺体, 如胰腺腺泡细胞, 在建立和维持这些组织的分泌功能中起关键作用[16], 小鼠E1 3 d胰腺导管周围细胞核Mist1染色阳性, Mist1-/-小鼠出生后胰腺腺泡进行性破坏, 结构紊乱, 细胞极性消失, 酶原提前激活及受调胞吐异常, IP3R3表达缺失, 类似于胰腺炎表现[6]. 基于本实验中PTF1-P48, Mist1及多种消化性酶的表达趋势可以认为在E15.5-E 18.5胰腺外分泌部处于功能完善活跃时期, PTF1-P48和Mist1在此过程中起了重要作用, 至于Mist1是否直接增强IP3R3的表达有待证明, 但值得注意的是受调胞吐中的必需因子-VAMP2-并未表达, 可见此时外分泌部尚不具备分泌功能.

此外本实验中胰腺外分泌细胞分化标志物淀粉酶为E15.5, E 18.5均有表达, 但多种消化性酶如胰蛋白酶II, 羧肽酶B(Cpb), B2, 弹性蛋白酶2(Ela2), 甘油一酯酶以及CCKAR, Aquaporin 8均为E18.5特异表达, 这些基因都是外分泌胰腺行使其功能所必需的关键因子, 由此可见从E15.5至E18.5外分泌胰腺进入分化后功能完善阶段. 至于胰腺内外分泌部在此期的发育是否同步及二者发育是否需要相互间的协调作用则有待研究.

备注

编辑: N/A

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