IκB激酶在肝脏缺血再灌注中的作用

摘要

目的: 探讨IκB激酶(IKK)在肝脏缺血再灌注(HIR)中的作用.

方法: Wister大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组(HIR组)、PDTC保护组(HIR+PDT组). HIR组将肝左叶及肝中叶入肝血流阻断60 min后再灌注. 保护组先经阴茎背静脉注射PDTC 120 mg/kg^-1后立即依HIR组致伤, 对照组仅显露肝中叶及肝左叶肝蒂, 不阻断, 自阴茎背静脉注射无菌生理盐水1 mL. 分别采用原位杂交、EMSA、免疫组化及赖氏法检测再灌注后 1、6、12 h IκB激酶表达、NF-κB活性、TNF-α的表达及血浆中ALT含量.

结果: 损伤后IκB激酶表达水平、NF-κB结合活性、TNF-α表达水平、血浆中ALT含量升高; HIR+PDTC组与HIR组相比较, IκB激酶表达水平、NF-κB活性、TNF-α表达水平、血浆ALT水平降低.

结论: HIR后肝内IκB激酶可促进 NF-κB的高水平激活引起肝内TNF-α等炎症相关细胞因子表达增强, 从而导致肝脏损伤. 干预IKK-NF-κB通路可能是防止HIR后急性肝脏损伤发生、发展的一个有效途径.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: February 3, 2004
Revised: February 10, 2004
Accepted: February 21, 2004
Published online: August 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

肝脏缺血再灌注(hepatic ischemia reperfusion, HIR)是肝脏疾病和创伤中常见的病理过程. IκB激酶(IKK)-β是活化核因子(NF)-κB关键的上游分子, 是NF-κB发挥基因转录调节功能的前提. NF-κB是一种广泛存在的快反应转录因子, 可上调炎症因子的基因转录而引发炎症瀑布反应, 诱导肝脏损伤[1-3]. 本实验通过制备动物HIR模型, 观察肝脏组织中IKK-β的表达、NF-κB的活化情况以及肝脏组织中NF-κB的下游因子肿瘤坏死因子(TNF)-β表达, 探讨IKK-β在HIR继发急性肝损伤(ALI)的病理机制中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物: ♂Wister大鼠54只, 体质量250-300 g, 由第四军医大学实验动物中心提供. 主要试剂: IκB激酶原位杂交试剂盒(武汉博士德); NF-κB的寡核苷酸结合序列(Promega): 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'; 3'-T CAACTCCGCTGAAAGGGTC CG-5'.

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作: 选择试验Wister大鼠, 随机分为对照组、HIR组和HIR+PDTC组. 每组18只. HIR组经阴茎背静脉注射无菌生理盐水1 mL后用无损伤动脉夹阻断肝左叶及肝中叶入肝血流, 缺血时间为1 h; HIR+PDTC组经阴茎背静脉注射吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐(PDTC) 120 mg/kg^-1后立即依HIR组方法致伤; 对照组仅显露肝中叶及肝左叶肝蒂, 不阻断, 阴茎背静脉注射无菌生理盐水1 mL. 分别于再灌注后 1, 6, 12 h 3个时间点处死动物, 取材(每时间点6只).

1.2.2 肝脏组织中IKK-β及TNF-α的表达: 原位杂交及免疫组化法行IKK-β、TNF-α检测.

1.2.3 肝脏组织中NF-κB的蛋白结合活性测定: 提取核蛋白并用凝胶迁移电泳(EMSA)法测定NF-κB活性[4].

1.2.4 血浆中ALT含量的测定: 各时相动物活杀并于下腔静脉穿刺抽取血标本2 mL, 采用赖氏法行血浆ALT检测.

用Leica Q 500Mc图像分析仪进行半定量分析, 以吸光度(A)来表示IKK-β、TNF-α表达水平和NF-κB相对活性高低. 采用SPSS统计分析软件进行统计学分析. 半定量资料比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为显著性标准.

2 结果

2.1 肝脏组织中IKK-β表达

HIR损伤后IKK-βmRNA表达较对照组明显增加, 可于再灌注后6 h达到高峰, 应用PDTC预处理组IKK-βmRNA表达水平降低(表1).

表1 各组动物肝组织IKK-βmRNA表达的变化(A, mean±SD).

组别	n	1 h	6 h	12 h
对照组	6	0.023±0.003	0.026±0.003	0.029±0.005
HIR组	6	0.152±0.016b	0.200±0.019b	0.077±0.010b
HIR+PDTC组	6	0.118±0.010bd	0.145±0.011bd	0.050±0.008ad

^bP<0.01, ^aP<0.05 vs 对照组;

^dP<0.01 vs HIR组.

2.2 肝脏组织细胞中NF-κB的活性

HIR损伤后NF-κB活性较对照组明显增加, 可于再灌注后6 h达到高峰, 应用PDTC预处理组NF-κB活性明显减弱(表2).

表2 HIR后肝组织NF-κB活性改变(A, mean±SD).

组别	n	1 h	6 h	12 h
对照组	6	0.08±0.03	0.04±0.02	0.06±0.02
HIR组	6	10.60±2.59b	11.52±2.01b	6.83±1.96b
HIR+PDTC组	6	3.49±0.96a	7.15±3.37a	2.52±0.64a

^bP<0.001 vs 对照组;

^aP<0.05 vs HIR组.

2.3 肝脏组织中TNF-α的表达

HIR损伤后TNF-α基因表达明显高于对照组, 于再灌注后6 h达到高峰, 应用PDTC预处理能明显降低 (表3).

表3 HIR后肝脏TNF-α的表达(A, mean±SD).

组别	n	1 h	6 h	12 h
对照组	6	2.13±1.24	2.42±0.84	1.73±1.41
HIR组	6	17.8±1.77b	20.87±3.4b	16.10±2.58b
HIR+PDTC组	6	13.02±3.24a	15.44±1.91a	14.63±1.32

^bP<0.001 vs 对照组;

^aP<0.05 vs HIR组.

2.4 血浆中ALT含量的变化

损伤后血浆中ALT含量较对照组明显增加, 并于再灌注后1 h达到高峰, PDTC预处理组血浆中ALT含量较HIR损伤组降低(表4).

表4 肝脏缺血再灌HIR后血浆中ALT含量变化(IU/L, mean±SD).

组别	n	1 h	6 h	12 h
对照组	6	47.00±7.60	52.02±4.96	48.56±13.07
HIR组	6	256.13±26.66b	244.25±30.14b	205.98±69.96b
HIR+PDTC组	6	241.53±20.72	163.45±10.18a	129.45±13.87a

^bP<0.001 vs 对照组;

^aP<0.05 vs HIR组.

2.5 组织形态学变化

光镜下与对照组比较, HIR组肝脏缺血明显, 肝细胞不同程度肿胀变性和空泡样变性, 部分可见点状坏死及局灶性片状坏死, PDTC处理组组织变性及坏死减轻.

3 讨论

HIR损伤仍然是肝脏部分切除及肝移植的严重制约之一, 进一步探讨HIR损伤机制对肝移植及肝部分切除术后肝脏功能的保护具有特别重要意义. Omoya et al[5]进行的肝细胞在经历氧化环境下NF-κB活性研究表明氧自由基可使IκB减少, 核内NF-κB活性增强.Yoshidome et al[6]对大鼠部分肝缺血再灌注后肝内NF-κB的活性变化进行研究表明, 损伤后NF-κB核转移并激活, 于4 h达到高峰, IL-10可抑制NF-κB激活, 从而减轻肝损伤.

我们制备大鼠HIR模型, 检测HIR后肝脏组织中 IKK-βmRNA的表达及细胞核中NF-κB的蛋白结合活性. 结果显示HIR组动物肝脏组织中IKK-βmRNA的表达、NF-κB 的活性以及中TNF-α的表达均明显增加, 并与肝脏组织损害程度、ALT增高程度相关; IKK-βmRNA的表达和NF-κB的活化在HIR后1 h即达较高水平, 6 h达到峰值, TNF-α的释放高峰在6 h, 并同时伴有严重的肝脏组织炎症反应. 提示机体受到HIR刺激后, 可增加IKK的表达, 促进NF-κB的活化和核移位, 与DNA特异部位结合, 调控基因转录活化, 诱导细胞合成各种生物大分子[7-8], 从而上调TNF-α的基因转录. TNF-α作为细胞因子网络的启动因子, 进一步诱发ALI. 说明IKK-β是HIR继发急性肝脏损伤的关键环节; TNF-α在炎症瀑布反应的启动中发挥重要作用.

PDTC可明显缓解治疗组动物肝脏的炎症反应, 同时明显降低肝脏组织IKK-βmRNA的表达、NF-κB的活化以及肝脏组织中TNF-α表达水平. 说明PDTC的抗炎作用机制可能是通过减少IKK-β的表达, 下调IKK-NF-κB通路, 在基因转录水平降低细胞因子的合成和释放, 遏制炎症瀑布反应, 从而减轻组织损伤. 提示干预IKK-NF-κB通路可能是防止HIR后急性肝脏损伤发生、发展的一个有效途径, PDTC对预防和治疗HIR后急性肝脏损伤有重要意义.

备注

编辑: N/A

参考文献

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