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世界华人消化杂志. 2004-07-15; 12(7): 1721-1723
在线出版日期: 2004-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i7.1721
针刺对胃黏膜损伤家兔表皮生长因子、生长抑素及生长抑素受体基因表达的影响
易受乡, 阳仁达, 严洁, 常小荣, 林亚平
易受乡, 阳仁达, 严洁, 常小荣, 林亚平, 湖南中医学院针灸推拿系 湖南省长沙市 410007
基金项目: 国家自然科学基金资助课题, No. 30171136; 湖南省教育厅资助课题, No. 01A013.
通讯作者: 易受乡, 410007, 湖南省长沙市韶山中路113号, 湖南中医学院针灸推拿系. yishouxiang@yahoo.com
电话: 0731-5381161 传真: 0731-5557891
收稿日期: 2003-12-10
修回日期: 2004-01-01
接受日期: 2004-02-18
在线出版日期: 2004-07-15

目的: 为了证实针刺足阳明经对胃黏膜损伤的保护作用, 对表皮生长因子(EGF)、生长抑素(SS)及生长抑素受体基因(SSR1 mRNA)表达影响, 从多层次探讨经脉-脏腑相关的特异性.

方法: 40只家兔随机分为: A对照组, B胃溃疡模型组, C足阳明胃经(胃经)组, D足少阳胆经(胆经)组, E足太阳膀胱经(膀胱经)组. 乙醇灌胃造成家兔胃溃疡模型后, 采用经络刺激仪对C－E组分别针刺胃经、胆经、膀胱经(穴)7 d. 治疗结束后测定以上各组胃黏膜损伤指数, 用放射免疫及RT－PCR法分别测定胃黏膜EGF、SS及SSR1 mRNA表达.

结果: 模型组EGF含量(73.6±14.8)较正常组(91.3±14.9)明显降低(P<0.01); 胃黏膜损伤指数(24.88±6.29)、SS含量(2978.6±587.6)及SSR1 mRNA表达(2.56±0.25)较正常组(8.50±2.98)、 (1852.4±361.7)、(1.04±0.36)显著升高(P<0.01). 胃经组EGF(92.2±6.7)、胃黏膜损伤指数(10.88±3.23)、SS含量(1 800.2±488.1)及SSR1 mRNA表达(1.07±0.08) 与模型组比较有显著差异(P<0.01). 但胆经及膀胱经组与模型组比较上述指标未得到改善, 与胃经组比较有显著差异(P<0.01或0.05).

结论: 针刺足三阳经对家兔胃黏膜损伤的保护作用以胃经组的作用最强, 其机制可能是通过调整有关脑肠肽及生长抑素受体基因表达有关. 上述结果为经脉-脏腑相关的特异性提供了一定实验依椐.

关键词: N/A
引文著录: 易受乡, 阳仁达, 严洁, 常小荣, 林亚平. 针刺对胃黏膜损伤家兔表皮生长因子、生长抑素及生长抑素受体基因表达的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1721-1723
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: December 10, 2003
Revised: January 1, 2004
Accepted: February 18, 2004
Published online: July 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

在以往的研究中发现, 针刺足阳明经穴对家兔胃黏膜损伤有明显的保护作用[1], 为进一步探讨其作用机制及经脉作用的特异性, 本研究以实验性胃溃疡家兔为模型, 比较了针刺足阳明、足少阳及足太阳等不同经脉(穴位)对家兔胃黏膜损伤指数、相关脑肠肽及胃黏膜生长抑素受体基因表达的影响, 力求从多层次、多水平探讨足阳明经与胃相关的规律性.

1 材料和方法
1.1 材料

TRIZOL试剂(GZBCO BRL公司), 逆转录试剂盒, Tag DNA聚合酶(Progmego公司). 表皮生长因子(EGF)和生长抑素(SS)放免试剂盒由北京华英放免技术研究所提供. Eppendorf低温冷冻离心机, Strategene Eagle EyeⅡ图像分析处理系统(美国STRATAGENE公司), 玄手牌经络疏通仪(中国和平经济技术咨询公司)

1.2 方法

1.2.1 实验性胃溃疡模型制备: 采用乙醇造模法[2]. 动物禁食48 h, 用无水乙醇按2.35 mL/kg体重剂量灌胃造模, 24 h后恢复普通饮食, 对照组用等量生理盐水灌胃.

1.2.2 动物分组及处理方法: 新西兰纯种家兔40只, 体质量1.5-2.5 kg, 月龄3-4 mo, 雌雄兼用, 由本院实验动物中心提供. 将40只家兔随机分为5组, 每组8只. 即A: 空白对照组(空白组); B: 胃溃疡模型组(模型组); C: 针刺足阳明经穴组(胃经组); D: 针刺足少阳经穴组(胆经组); E: 针刺足太阳经穴组(膀胱经组). A组采用生理盐水灌胃, B-E组采用无水乙醇灌胃造模, 造模后C-E组分别针刺胃经、胆经及膀胱经各7 d. 疗程结束后各组动物处死, 摘取胃黏膜作指标检测.

1.2.3 穴位定位与针刺方法: 穴位定位参照《实验针灸学》[3]常用实验动物的针灸穴位定位及拟人比照法[4]制订. 足阳明经取"内庭"、"解溪"、"足三里"、"梁丘"、"天枢"、"梁门"6个穴位为刺激点, 其他经脉均以此为参照, 选取同水平段上相应部位的穴(点)为对照刺激点. 针刺方法: 采用玄手牌经络疏通仪行循经逐点动态刺激法[5]. 仪器启动后进入编程状态: 选择单向运行时序, 步进速度为0.5 s. 刺激参数选择双向脉冲、连续波, 频率50 Hz, 波宽0.5 ms. 将仪器输出夹分别夹在沿体表所选经脉穴位固定的6根不锈钢的针柄上, 使刺激兴奋顺序由下肢传向躯干, 反复运行, 输出强度控制在"2-3"档之间. 针刺每日1次, 每次刺激时间均为30 min, 连续7 d.

1.2.4 指标检测:

1.2.4.1 胃黏膜损伤指数: 针刺治疗7 d后动物处死, 剖腹取出胃, 从幽门至贲门剪开胃, 清洗胃内容物, 依照Guth记分法[6]计算胃黏膜损伤指数.

1.2.4.2 EGF、SS测定: 胃黏膜组织匀浆后, 按试剂盒要求处理标本, 采用放射免疫法检测EGF、SS含量.

1.2.4.3 SSR1 mRNA表达水平测定: SSR1 mRNA表达水平采用RT－PCR法: (1)RNA的提取与纯化: 用消毒手术刀切取胃黏膜组织1小块, 置于盛有液氮的研钵中研磨成细粉, 采用Trizol试剂盒, 以一步法提取组织总RNA. 电泳可见明显的28S、18S、5S rRNA条带, 所有样本总RNA的A260/A280比值在1.7-1.95之间. (2)逆转录(RT)反应: 以Oligo(dT)18为引物(30 pmoL/L)于65 ℃, 5 min逆转录2 g总RNA样品中的mRNA为cDNA, 20 L逆转录反应体系中含20 u RNA酶抑制剂(Promega 公司)、0.5 mmoL/L dNTP, 10 u AMV逆转录酶及5×RT缓冲液. (3)聚合酶链反应(PCR): 用下列引物(由上海博亚公司提供)进行PCR反应. SSR1(生长抑素受体有5个亚型, 本实验只做在胃黏膜表达最强的第1个, 即SSRl)有义引物为: 5'-CAAGACGACGCCACCGTGAGCCA-3', 反义引物为: 5'-GGGGTTGGCACAGCTGTTG-3'; 内对照亲环素蛋白(Cyclophilin, cyc)有义引物为: 5'-CCATCGTGTCATCAAGGACTT CAT-3', 反义引物为: 5'-TTGCCATCCAGCCAGGAGGTCT-3'. 50 L PCR反应体系中含10×PCR反应缓冲液5 L, MgCl2 1.5 moL/L, dNTP 200 moL/L, 模板cDNA 5 L, 特异引物均为0.1 mmoL/L, Taq DNA聚合酶3 u, 石蜡油覆盖. SSR1和cyc cDNA的PCR反应条件为: 94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 26个循环; 经最后一次循环后于72 ℃再延伸5 min. (4)电泳: 取10 L×PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶中电泳, SSRl产物为66 bp, cyc产物为216 bp, 经溴乙锭染色后, 紫外灯下照相, 并经图像识别分析系统进行电泳条带光密度扫描, SSR1 mRNA的相对表达水平用SSR1/cyc的比值计算.

统计学处理 所有数据均以mean±SD表示, 用SPSS10.0软件进行统计学处理. 组间比较若方差齐时选择LSD法, 方差不齐时选择DunnettT3法进行方差分析和两两比较, P<0.05具有统计学意义.

2 结果
2.1 针刺对胃黏膜损伤指数影响

模型组胃黏膜损伤指数最高, 与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.01). 电针治疗后, 胃经组与模型组比较, 损伤指数明显降低(P<0.01), 而其他各针刺组与模型组比较, 无显著性差异(P>0.05). 各电针治疗组之间比较, 胃经组损伤指数明显低于针刺足少阳、足太阳经组(P<0.01)(表1). 说明: 针刺足阳明经穴能显著降低实验性胃溃疡家兔胃黏膜损伤指数.

表1 各组胃黏膜损伤指数比较(mean±SD).
组别n胃黏膜损伤指数(记分法)
空白组88.50±2.98b
模型组824.88±6.29d
胃经组810.88±3.23b
胆经组819.38±3.66d
膀胱经组824.13±1.64d
bP<0.01 vs 模型组;
dP<0.01 vs 胃经组.
2.2 针刺对胃黏膜EGF及SS含量的影响

空白组胃黏膜EGF含量明显高于模型组, SS含量明显低于模型组, 且均有显著性差异(P<0.01).胃经组胃黏膜EGF含量明显高于模型组及其他各针刺组, SS含量明显低于模型组及其他各针刺组(P<0.01或P<0.05)(表2). 说明: 针刺足阳明经穴使胃溃疡家兔胃黏膜EGF含量明显升高, 使SS含量明显降低.

表2 各组胃黏膜EGF、SS含量比较(mean±SD).
组别nEGF(pg/mL)SS (mIU/mL)
空白组891.3±14.9b1 852.4±361.7b
模型组873.6±14.8d2 978.6±587.6d
胃经组892.2±6.7b1 800.2±488.1b
胆经组874.9±9.0d2 441.0±488.1ac
膀胱经组865.4±12.8d2 592.7±426.8d
aP<0.05,
bP<0.01 vs 模型组;
cP<0.05,
dP<0.01 vs 胃经组.
2.3 针刺对胃黏膜SSR1 mRNA表达的影响

空白组胃黏膜SSR1 mRNA表达强度明显低于模型组, 且二者有显著性差异(P<0.01). 比较针刺不同经脉组对胃黏膜SSR1 mRNA表达的影响, 其减低程度依次为针刺足阳明经组>针刺足少阳经组>针刺足太阳经组, 与胃经组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)(表3). 说明: 针刺足阳明经穴对实验性胃溃疡家兔生长抑素受体基因表达的抑制作用最强.

表3 各组胃黏膜SSR1mRNA表达的比较(SSR1/cyc).
组别nmean±SD
空白组31.04±0.36b
模型组32.56±0.25d
胃经组31.07±0.08b
胆经组31.73±0.16ab
膀胱经组32.39±0.39d
bP<0.01 vs 模型组;
aP<0.05,
dP<0.01 vs 胃经组.
3 讨论

细胞保护(Cytoprotection)是指某些物质具有防止或明显减轻有害物质对消化道上皮细胞损伤和致坏死作用的能力, 也包括拮抗溃疡作用. 本研究显示针刺足阳明经穴可降低胃黏膜损伤指数, 说明对胃黏膜损伤具有一定的保护作用.

EGF主要由唾液腺、十二指肠勃氏(Brunner)腺及胰腺分泌[7], 具有较强的抗酸性, 能抵抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的破坏, 抑制胃酸、胃蛋白酶分泌, 增加胃黏膜细胞黏液产生, 刺激黏膜上皮细胞增生, 增加黏膜DNA合成, 防止溃疡的形成[8-10]. 临床显示EGF可使胃、十二指肠溃疡愈合速度明显加快[11-13]. 本研究发现, 针刺足阳明经穴能显著升高实验性胃溃疡家兔胃黏膜EGF的含量, 且与模型组及其他各针刺组比较, 有显著性差异. 说明针刺足阳明经可能通过调整EGF促进胃黏膜的修复.

生长抑素是消化道中主要起抑制作用的激素, 能抑制胃肠激素的释放与活性. 生长抑素受体(SSR)广泛存在于胃肠道及中枢神经系统中, 由5个亚型组成, 其中SSR1在胃的表达最强. SS由这些受体介导抑制胃泌素、组胺及胃酸的分泌, 在胃酸的调节中起十分重要的作用. SS还可抑制消化道血流及胃肠上皮细胞的增生[14-16].SS在溃疡病中的变化, 结果报告不一[17-18]. 认为溃疡病SS降低的理由是溃疡病胃黏膜SS贮存量及释放量减低, 不足以约制胃酸, 以至呈现高胃酸状态而引起溃疡; 认为SS水平升高的理由是高胃酸状态反馈性刺激所出现的代偿机制, 机体企图藉此加强对胃酸的抑制. 本研究结果显示实验性胃溃疡家兔SS及SSR1表达升高, 可能是由于代偿反馈所致.

Konturek et al[19]发现胃黏膜SS可发挥生长抑制作用, 拮抗许多EGF等生长因子的营养作用, 抑制胃黏膜、胃肠上皮细胞增生和黏膜的愈合, 因而在很大程度上抑制了实验性大鼠溃疡的愈合. Pfeiffer et al[20]也发现: 大鼠实验性胃溃疡愈合过程中表皮生长因子受体表达增多, 而生长抑素受体表达减少, 在溃疡灶部位甚至是持久性缺乏. 本研究显示针刺足阳明经后SS及SSR1表达均较模型组低, 一方面可能是由于针刺减轻了溃疡损伤, 因而代偿反馈作用减弱; 另一方面提示在溃疡愈合过程中, SS对细胞增生作用减弱, 意味着允许生长因子的营养性充分表现, 从而促进溃疡愈合, 对修复过程中是有益的表现[21].

本研究比较了针刺足三阳经穴对实验性胃溃疡家兔胃黏膜损伤保护作用的强弱, 结果表明针刺足阳明经穴作用最强, 足少阳经穴次之, 足太阳经穴作用最差. 说明: 足阳明经与胃关系最为密切, 足少阳经次之, 足太阳经与胃的联系不密切. 这一结果与传统经络理论及针灸临床实践相吻合, 同时也再次证实了足阳明经与胃的相关特异性.

编辑: N/A

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