文献综述 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-07-15; 12(7): 1674-1677
在线出版日期: 2004-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i7.1674
乙型肝炎病毒DNA YMDD变异的检测技术
蔺淑梅, 成军, 张树林
蔺淑梅, 成军, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-02-14
修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-05-11
在线出版日期: 2004-07-15

拉米夫定治疗乙型肝炎耐药性的产生主要与HBV P基因突变有关, 耐药株中多见P基因变异且相对集中于YMDD基序. YMDD变异的检测技术包括核苷酸序列测定法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析、基因芯片技术、聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法等. 本文就乙型肝炎病毒DNA YMDD变异的检测技术作一综述.

关键词: N/A
引文著录: 蔺淑梅, 成军, 张树林. 乙型肝炎病毒DNA YMDD变异的检测技术. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1674-1677
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: February 14, 2004
Revised: April 1, 2004
Accepted: May 11, 2004
Published online: July 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

核苷类似物拉米夫定治疗乙型肝炎的主要机制为抑制乙型肝炎病毒(HBV)DNA多聚酶(P)基因, 从而干扰病毒逆转录过程, 阻碍病毒DNA的合成和转录. 拉米夫定可迅速抑制慢性乙型肝炎患者体内的HBV复制, 使患者血清HBV DNA转阴, 在慢性乙型肝炎抗病毒治疗中显示了令人鼓舞的效应. 但临床应用中发现, 拉米夫定用药过程中部分患者可出现耐药现象, 导致患者HBV DNA反跳, 病情反复, 极少数患者还会出现病情恶化. 已有的研究表明, 拉米夫定耐药性的产生主要与HBV P基因突变有关, 耐药株中多见P基因变异且相对集中于YMDD基序[1]. YMDD变异通常有2种形式: 一种为P区741位鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代(G→T), 则其编码的550位的蛋氨酸变为亮氨酸(YMDD→YIDD); 另一种为第739位腺嘌呤被鸟嘌呤取代(A→G), 则其编码的550位的蛋氨酸变为缬氨酸(YMDD→YVDD)[2].YMDD结构域是HBV进行逆转录的生物活性部位[3], 也恰恰是拉米夫定干扰HBV复制的药物结合位点, 这2种变异均导致了拉米夫定与多聚酶亲合力的下降或消失, 体外实验也得到证实, YMDD变异株对拉米夫定的敏感性降低为野生株的万分之一[4-5] . 最近不少学者还发现在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者也存在YMDD变异, 即这类患者对拉米夫定存在先天性耐药[6-11]. 因此, 拉米夫定治疗前及治疗期间监测YMDD的变化对选择治疗方案及调整治疗用药, 提高疗效都具有十分重要的意义. 现就目前YMDD变异的实验室检测方法综述如下.

1 检测方法
1.1 核苷酸序列测定法

YMDD突变的经典检测方法为DNA测序法, 测序法也是检测HBV DNA多聚酶基因YMDD突变的金标准, 包括聚合酶链反应(PCR)产物直接测序和重组克隆测序检测P基因YMDD变异. 有人[12-14]分别采用聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、PCR产物直接测序和重组克隆测序检测P基因YMDD变异, 认为克隆后测序的结果最精确. Honkoop et al[15]采用测序法检测在拉米夫定治疗过程中HBV DNA再次出现阳性的5例慢性乙型肝炎患者血清, 发现4例存在YMDD基序的变异. 张永忠et al[16]采用PCR产物直接测序技术检测了拉米夫定治疗48 wk后血清HBV DNA仍阳性的38例患者血清中HBV DNA P基因序列, 并推到为相对应的氨基酸序列, 同时和GenBank中标准株序列相比较, 结果有20例患者检出YMDD变异, 其中YVDD型8例, 都伴有L526-M变异, YIDD型12例, 其中2例伴有L526-M变异.

目前国外报道的HBV拉米夫定耐药株的检测多采用DNA测序的方法, 测序法虽然可靠, 也可检测出多位点的变异, 但只能检测血清中的一种优势株, 对于混合型感染通常不能识别, 而且由于技术难度及实验成本等诸多因素, 限制了他的临床应用, 不适合开展大规模标本的临床检测.

1.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法

错配聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术检测HBV YMDD变异株的结果均显示, 错配PCR结合RFLP分析技术能有效地鉴别HBV YMDD野生株和变异株, 与测序同样灵敏、特异[13-14,17-19], 但实验简便、快速, 无需特殊仪器, 适合于一般实验室应用及大规模临床检验使用. 限制性片断长度多态性分析是用某一限制性内切酶对目的DNA进行酶切后所产生的酶切图谱进行多态性分析的方法. 由于核酸限制性内切酶对DNA特定序列识别切割的专一性, 不同序列的DNA切割后产生长短不一的DNA片段, 在凝胶电泳产生不同的酶切图谱, 分析这些不同的图谱就可以区分不同序列的DNA. 错配PCR实验的目的就是在PCR扩增片段中引进一个限制性内切酶识别序列, 从而改变目的DNA的酶切图谱, 区别变异株与野生株. 方法是利用野生株设计错配引物对HBV DNA进行扩增, 使得到的P基因片段扩增产物的第736位碱基由T变为C, 从而在HBV野生株P基因C区引进一个Nde I(CA↑TATG)酶切位点, 而此酶切位点附近任一碱基变异均将导致此酶切位点消失(YMDD变异株无此酶切位点, 不能切开), 最后通过酶切后电泳区分野生株和变异株. 由于P基因YMDD区域高度保守, 减少了YMDD周边区域点突变影响酶切结果的可能性.

张伟三et al[17]根据已公布的HBV DNA序列, 在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物, 其中一只为错配引物, 建立了巢式错配PCR-限制性片段长度多态性分析技术. 应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段, 扩增产物用限制性内切酶(Nde I)酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性图谱, 并与DNA测序结果进行比较. 应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测, 发现YMDD变异者9例 (45%), YMDD野毒株者11例(55%), 表明该方法可有效地鉴别HBV YMDD野毒株与变异株且灵敏度高, 可以检出已知HBV DNA定量106拷贝/L的血清标本,特异性强, 检测结果与测序结果相吻合. 唐漾波et al[18]采用套式/错配PCR结合RFLP分析技术检测了经过拉米夫定抗病毒治疗后HBV DNA仍为阳性的45例慢性乙型肝炎患者血清, 结果检出HBV YMDD野生株23例和变异株22例. 作者认为从理论上来说, 此方法能有效地检测出混合株的感染, 但在实验中, 未检出任何混合株的感染, 可能原因为体内的感染任何时候都存在优势株, 这种优势株能被检测到, 而非优势株可能由于在体内感染量有限而不被检测到. 因此, 作者建议先用该方法对临床可疑病例进行筛查, 然后用PCR产物克隆后测序的方法进行进一步的HBV YMDD变异的检测, 这样可以进一步提高敏感性及混合株的检出率.

为进一步区分YMDD变异的类型, 有学者[12,20-22]将限制性内切酶切点带入变异型特异性引物内, 扩增产物经酶切分析可准确地检出YMDD变异. Yang et al[12]应用PCR-RFLP检测了拉米夫定治疗过程中HBV DNA反跳的33例及拉米夫定治疗过程中HBV DNA持续阳性1 a以上的2例慢性乙型肝炎患者血清, 结果检出YIDD 变异株4例, YVDD变异株6例, 1例为 YIDD/MDD混合感染, 所有检测结果与直接测序结果一致. 杜绍财et al[21]采用限制性内切酶酶切位点引入法设计引物(在合成引物时带入酶切位点)检测YIDD, YVDD, 内切酶分析, PAGE电泳法检测基因变异. YMDD、YIDD、YVDD的判断: 有SspⅠ切点为YIDD, 有ApaLⅠ切点为YVDD, 无切点为YMDD, 结果显示应用SspⅠ及ApaL内切酶可准确地检测出YIDD和YVDD. 裴斐et al[22]对肝移植术后出现乙型肝炎复发的5例患者进行HBV DNA多聚酶基因片段 (包含YMDD结构域) 的扩增和测序, 以及采用PCR-RFLP法检测HBV DNA多聚酶基因的YMDD突变, 其中4例为野生型YMDD, 1例发生了YIDD突变, PCR-RFLP检测HBV YMDD突变的结果与直接DNA测序结果完全吻合.

1.3 基因芯片技术

基因芯片(gene chip), 又称基因微矩阵(microarray), 其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上, 然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交, 通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度, 经计算机分析处理数据资料, 获取样品分子的数量和序列信息, 从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究. 基因芯片技术由于其具有大通量、快速、灵敏、平行检测基因的优势, 已在生物学的各个领域中得到广泛的应用. 国内外学者的多组研究显示, 用基因芯片检测基因突变, 检测准确率高达99%, 有学者同时运用芯片检测技术和传统DNA序列分析法分别检测癌基因突变情况并进行比较, 结果表明芯片检测法敏感性达92%, 特异性为100%, 说明基因芯片有较高的特异性及灵敏度[23-24], 且具有所需样本微量和操作简便等特点. 因此, 许多学者[25-28]将基因芯片法用于YMDD变异的检测, 结果表明, 基因芯片法检测YMDD变异, 快速、准确、重复率高, 不仅能同时检测出多个点位的变异, 而且能检测出野生株和变异株共存即混合感染, 与其他检测方法相比有明显优势, 在临床上是一种可应用的方法.

张新华et al[25]用PCR方法扩增HBV DNA P区, 扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸进行杂交, 杂交结果通过扫描仪扫描到计算机上, 经软件分析可得到HBV YMDD野生型及其YVDD和/或YIDD变异型结果, 并对部分阳性标本用基因序列测序证实. 结果150份HBV DNA阳性血清, 用基因芯片方法检出阳性标本(包括YMDD野生型和变异型)共122例, 单纯YMDD野生型有90例, YVDD变异28例, YIDD变异2例, YVDD和YIDD混合变异2例, 而且变异株均与野生株共存, 对其中8份阳性标本进行基因序列测序, 证实与芯片检测结果完全一致. 计焱焱et al[27] 用基因芯片法测定20份拉米夫定治疗1年的血清, 14例检出YMDD变异株. 14例YMDD变异株中, YVDD13例(其中5例变异株和野生株同时存在, 2例合并YIDD, 1例为YVDD合并YIDD), 1例为单独YIDD变异, 基因芯片法和DNA测序法检测结果比较, 显示YMDD变异检测率基本相符.

1.4 聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法

聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法(PCRmnh-ELISA)法是一种将基因扩增、核酸杂交和酶联显色3种诊断技术为一体的检测技术, 他既解决了PCR产物的特异性检测, 又通过酶系统的放大作用提高了检测的灵敏度. 有学者[29-31]采用该方法检测慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗前及治疗过程中HBV YMDD变异, 结果显示YMDD变异检测率与DNA测序法检测结果一致. Zhou et al[29]采用PCR微板核酸杂交ELISA技术检测47例慢性乙型肝炎患者服用拉米夫定治疗前及治疗后DNA含量及YMDD耐药突变株(包括YIDD及YVDD突变株), 结果显示有19%(9/47)的患者出现YMDD变异株, 作者将PCR微板核酸杂交检测的YMDD野生株、YIDD及YVDD耐药株与测序结果进行比较, 二者相吻合. 谢南et al[31]应用该方法检测了90例服用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者血清, 结果显示, 口服拉米夫定12 mo和24 mo后, YMDD耐药株的发生率分别为16%(14/90)和27%(24/90), 并且对YMDD野生株、YIDD及YVDD突变株各取2例及1例先天性YMDD耐药株进行测序, 测序结果与PCR微板核酸杂交ELISA结果相同, 作者认为PCR微板核酸杂交ELISA技术检测YMDD耐药突变株(YIDD/YVDD), 具有结果准确、成本低、操作方便、时间短的优点, 一次可检测数十个标本, 经初步比较与直接测序结果一致, 值得进一步试用.胡盈莹et al[32]的研究则显示该方法虽敏感性高, 但特异性低, 实验中用该方该检测的13例突变株, 经测序证实仅一例为突变株, 其余均为野生株. 因此PCRmnh-ELISA方法在检测YMDD变异中的应用价值值得进一步评价.

1.5 其他方法

有学者[33-35]采用实时荧光聚合酶链反应结合lightcycler技术分析了拉米夫定治疗中的YMDD突变, 结果与PCR直接测序完全符合. 认为该方法灵敏、特异且快速简便, 可用于临床拉米夫定治疗中YMDD变异的检测. 刘传苗et al[33]根据寡核苷酸探针与模板结合时, 不匹配碱基显著影响溶解温度的原理, 设计合成2条荧光标记的特异性探针, 用实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法对297例患者的354份血清标本进行扩增后溶解曲线分析(溶解曲线分析是在扩增循环完成后对扩增产物的分析, 突变株和野生株的核苷酸序列不同, 其Tm值不同, 用lightcycler软件对结果进行分析, 可实现完全的区分, 而达到突变检测的目的. 进行YMDD变异检测, 结果354份标本中, 检出YMDD变异株156份(44.1%), 其中混合株占34%(53/156), 有9份血清标本同时进行了DNA序列分析, 测序结果同本试验检测的结果完全一致. 作者认为该方法简便、快速、灵敏、经济. Cane et al[34]采用荧光标记的探针利用快速的PCR法检测HBV的耐药变异株, 与直接测序的结果比较, 显示两种方法的灵敏度及特异性相差不大, 而前者更为经济快捷.

2 临床应用

随着拉米夫定的广泛应用, 其治疗乙型肝炎出现耐药的现象也日趋明显, 目前各地报道YMDD变异的百分比尚不一致, 可能与检测YMDD变异的方法不同有关, 在临床应用中根据实际条件选择敏感、特异、快捷的检测YMDD变异的方法进行服药前及服药期间的监测则显得十分重要.

编辑: N/A

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