0 引言
乙型肝炎病毒(HBV)在慢性乙型肝炎(CHB)患者体内的持续复制, 可以导致不同程度的肝内炎症, 而且与肝硬化和肝细胞癌(HCC)的发生密切相关. HBsAg疫苗的广泛应用, 在一定程度上能够安全有效地预防HBV感染, 降低了感染的发生率[1], 而对于慢性HBV感染者, 应用抗病毒化学药物治疗, 在抑制病毒活跃复制、阻止威胁生命的肝脏疾病的发展方面也展现了良好的前景[2]. 有效地进行抗病毒治疗, 可以诱导疾病缓解, 阻止肝硬化进程, 防止出现肝衰竭和/或肝细胞癌的严重后果. HBV感染的肝细胞与宿主免疫反应之间复杂的相互作用极大地影响着疾病的临床过程, 因而影响了临床处理策略. 目前所用的抗病毒治疗主要是通过干预病毒复制过程或者针对宿主抗病毒的不同环节, 达到抵抗病毒、保护机体的作用, 但任何治疗方法都有其应用的局限性, 使HBV感染始终是困扰人们的难题, 寻找新的有效治疗药物也一直是人们不懈追求的目标.
目前只有干扰素(IFN)、拉米夫定、阿地福韦(ADV)是获批准的治疗CHB 的药物. 在HBeAg 阳性和HBeAg阴性的CHB患者, 这些药物治疗具有相似的短期作用与有限的长期效应, 因此, 需要寻找新的治疗措施, 以克服他们所存在的局限性. 最近几种新的抗HBV复合物正在评估之中, 其中包括恩替卡韦, emt-ricitabine(LMV的5-氟衍生物), clevudine(L-FMAU)以及其他的L-核苷例如L-脱氧胸腺嘧啶(L-dT).
另外, 某些免疫调节剂, 例如白介素-2(IL-2)、干扰素(IFN)、胸腺素、疫苗等的治疗效果尚有争议[3-4]; DNA疫苗治疗方法, 虽然理论上似乎很有吸引力, 但在临床应用方面却没有更大的进展[4-5]; 两种聚乙二醇化的干扰素, PEG-IFN-2b、PEG-IFN-2a, 是治疗慢性HCV的较有前途的药物, 最近已经应用于慢性乙型肝炎的治疗. 将来以上这些方法的发展会为临床工作者提供更多的治疗选择.
1 病毒的生命周期
要确认潜在的抗病毒靶点, 理解HBV生命周期是很关键的. 成熟的HBV病毒颗粒由整合了病毒表面蛋白的脂质双层包绕核粒核心组成. 核粒内部是结构紧凑、呈松弛环状结构的3.2 kb的部分双链DNA基因组, 具有重叠的开放读码框架(ORF), 分别编码HBsAg(L, M, S), HBcAg, HBeAg, 聚合酶和X蛋白.
HBV的复制始于病毒与肝细胞表面的受体黏附, 介导病毒进入细胞, 脱去核衣壳, 转移至细胞核, 松弛环状基因组通过宿主细胞机制转化成cccDNA, 这个复制中间体是产生各种HBV RNAs的转录模板, 包括前基因组RNA(pgRNA), 为病毒复制所必须, 也是有效治疗、控制CHB的主要障碍. 3.5 kb的pgRNA的转录发挥三方面的作用: (1)其翻译可以产生核心蛋白与聚合酶蛋白; (2) 参与核粒包装反应, 其特异性由一个特殊的位于pgRNA的5'-和3'-末端的称为茎-环-茎结构所决定, 宿主蛋白例如Hsp90可以稳定这种pol-ε的相互作用[6]. 顺式翻译的核心蛋白在pgRNA-pol复合物周围形成二聚体, 自我排列形成病毒核粒; (3) 一旦装配成核粒, pgRNA即发挥逆转录模板的作用: 聚合酶蛋白结合至5'-ε-结构, 作为自身引物起始并合成负链DNA的前3个核苷酸, 新生DNA再转位到pgRNA的3'-末端, 结合至12 nt的DR1互补序列, 负链DNA在此继续合成, 聚合酶蛋白的RNA酶H活性使模板pgRNA降解. 这个RNA寡聚体转移至12 nt重复的DR2, 开始合成正链DNA. 正链DNA从负链DNA的5'-末端延伸, 出现了第3条链转换. 这由在负链DNA模板的一个短的富余片段所促进, 这个片段与正链DNA 5'-末端的富余片段退火, 因而使基因组环化[7]. 聚合酶蛋白对正链DNA合成的成熟前终止引起特征性的部分双链基因组. 含有部分dsDNA的HBV核粒或者循环回核, 增加cccDNA的供应, 或者在内质网和高尔基体进一步组装. 成熟的病毒粒通过组成型分泌途径从细胞中运出.
2 宿主对CHB感染的反应
急、慢性HBV感染导致的肝脏疾病主要是由免疫反应介导, 理解对HBV免疫反应的复杂性与多样性, 具有免疫治疗意义. HBV感染的动物模型例如HBV-感染猿、HBV转基因鼠的应用, 对于研究免疫反应与肝脏疾病、病毒的控制与清除方面具有重要意义[8-9], 但是, 动物模型的应用尚存在一定的局限性, 尤其在HBV-转基因鼠模型中, 缺乏cccDNA的产生与加工等关键的HBV复制事件.
HBV感染的过程受到免疫反应强烈程度的影响. 感染早期、固有的和调节性免疫反应对于HBV的清除是很关键的. 抗原提呈细胞, 尤其是树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞, 在刺激CD4+辅助性T细胞、CD8+细胞毒性T细胞以控制肝内HBV复制中起着重要的作用. 根据所分泌细胞因子的不同, 这些细胞可分为Th1与Th2细胞, 诱导原发性细胞介导的免疫反应. Th1细胞主要产生IL-2 , Th2主要产生白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)和白介素-10(IL-10), 触发体液免疫反应以产生抗体. 当Th1、细胞毒T淋巴细胞(CTL)细胞都活化, 并对病毒包膜、聚合酶、核心蛋白产生多特异性抗体, 可达到对HBV的清除[10]. 主要活化Th2细胞以产生抗体的免疫反应可能会导致HBV感染的持续, 因此, T细胞亚群的不一致性可能是导致新生儿与成人急性感染过程中, HBV持续存在的原因之一.
一般认为, HBV清除是通过CTL活化的穿孔素或Fas-依赖性途径的细胞因子介导的对HBV感染细胞的破坏, 而现在有新的观点强调了细胞因子介导的非溶细胞性HBV 清除[9]: 在急性HBV感染的猿猴与HBV转基因鼠的研究中发现, 细胞因子, 主要是肿瘤坏死因子(TNF), IFN和IFN/, 可以不必杀死肝细胞而抑制HBV复制; 在转基因鼠模型中诱导这些细胞因子, 能够至少干扰HBV生命周期的两条途径: HBV RNA的转录后降解以及清除含有pgRNA的非成熟核粒, 导致HBV核心蛋白的翻译后缺失[10]. IFN/可能活化与dsRNA-依赖的蛋白激酶(PKR)和dsRNA-依赖的2', 5'-寡腺苷酸合成酶有关的两条细胞路径, 对双链RNA蛋白激酶(PKR)的诱导可能导致HBV蛋白合成的抑制, 而对2', 5'-寡腺苷酸合成酶的诱导活化了RNase L以降解HBV RNA. IFN/和IFN可诱导细胞基因的转录改变[11]. 但是, 这些细胞因子诱导的作用于HBV复制的"分子抗病毒"的意义还不明确.
通过转基因鼠研究, 逐渐阐明了HBV RNA转录后降解的基本分子基础[9]. 研究表明, 在TNF和IFN被诱导后的病毒RNA降解过程中, 细胞蛋白-La蛋白, 发挥着一定的作用. 在HBV中, 这种蛋白特异地结合一个在病毒RNA内的位于转录后调节元件的茎-环结构5'-末端, 可能介导HBV RNA的核移出. 最近研究表明, La蛋白上的特异性HBV RNA结合点可能是潜在的抗病毒靶点. 目前, 尚不了解在CHB患者中控制HBV复制的非溶细胞过程的免疫反应. 从临床应用角度, 面对的挑战应该是建立免疫治疗方案, 克服少数炎症细胞浸润或肝细胞坏死的T-细胞低反应性[12-13], 开拓非溶细胞的HBV从肝细胞中清除过程.
3 新治疗靶点
HBV生命周期表明, 除了逆转录过程, 多数病毒过程依赖于宿主细胞机制, 其中最重要的是cccDNA的产生与持续存在. 传统的病毒DNA合成抑制物例如核苷类似物能够阻止或降低cccDNA新分子的产生, 但是, 成功清除已存在的嗜肝cccDNA只能通过非细胞溶解的Th1免疫反应或通过免疫介导的细胞杀伤作用[14-15]. 另外, 核苷类似物治疗CHB还能够(部分)恢复(特异性)免疫反应, 这一点很重要, 这对于介导宿主对感染的持久控制是必要的[16]. 总之, 成功治疗CHB的重点是集中到抗病毒与免疫调节方法治疗两方面内容上.
3.1 小分子抑制剂
核苷/核苷酸类似物是聚合酶抑制剂, 通过细胞激酶代谢成三磷酸形式, 能选择性或竞争性抑制病毒聚合酶的催化作用; 类似物的整合(如LMV和ADV)也可以导致新生病毒基因组的链终止; 另外, 由于在HBV负链DNA的引物序列的核苷酸是5'-GAA-3 ', 因而嘌呤核苷类似物能抑制聚合酶的引物活性[6-7,17]. 许多核苷/核苷酸类似物在CHB中的应用已得到检验, 例如拉米夫定、阿德夫韦、恩替卡韦、LY582563、MIV-210等.
最近发现另外几种复合物具有HBV抑制的机制, 但与病毒聚合酶不相关. 第1种是苯丙酰胺衍生物: AT-61和AT-130. King et al[18]表明AT-61并不影响总HBV RNA的产生或HBV DNA聚合酶的活性, 但确实能明显降低核壳化的RNA. 重要的是, AT-61和AT-130对于野生型和多种不同LMV-抗性株具有同样的抗病毒活性[19]. Feid et al[20]应用能够顺式包装HBV RNA的重组杆状病毒系统和一个能够反式包装HBV核心蛋白的表达载体系统观察了AT-130的作用机制: 体外研究表明, AT-130明显抑制了核壳化HBV RNA的产生, 但对于总HBV RNA没有作用, 也并不影响核心蛋白或核粒的产生, 表明其本身能够干扰核壳化过程, 其机制可能是通过空间抑制或者与宿主细胞伴随蛋白例如Hsp90相互作用. 苯丙酰胺不是水溶性的并具有极低的生物利用度, 成功地发展成抗病毒药还需要克服其潜在的毒性和药物化学事件. 但是, 这些发现证明了野生型与药物抗性HBV能够非依赖于病毒聚合酶而被选择性地在复制水平明显抑制.
体内、外实验还表明, 另一组复合物, 异芳基二氢嘧啶(HAP), 也是潜在的HBV复制的非核苷抑制子[21] , HAP复合物由Bayer公司发现, 包括的候选分子有Bay41-4109及其同种物Bay38-7690、Bay39-5493. 受Bay41-4109作用的HBV感染细胞, 通过抑制病毒核粒的形成导致核心蛋白的降解增加, 在HBV转基因鼠中也发现这些HAP复合物具有抗HBV的作用[21]. 这种新的作用机制和高度特异性的抗病毒作用表明, HAP复合物可能会进入将来的临床研究. 第3种复合物, LY582563, 是一种2-氨基-6-芳硫-9-磷甲氧乙基嘌呤双酯, 一种新的核苷类似物, 磷甲氧乙基嘌呤的衍生物, 其结构类似于ADV. 这种复合物具有极好的抗HBV活性和较低的毒性[22], 对于具有LMV-抗性的HBV也是有效的, 其作用机制及早期临床正在研究之中.
3.2 基因治疗方法
基因治疗是将新的基因材料导入靶细胞中, 以产生对宿主细胞的治疗作用. 抗病毒基因治疗策略如核酶、反义寡核苷酸、干扰肽或蛋白、治疗性DNA疫苗已经被研究用于CHB的分子治疗. 而且, 治疗或阻止CHB相关肝硬化或肝癌的分子策略也正在研究之中[5,23]. 一种新的分子治疗方法是siRNA. RNA干扰是一种序列特异性的基因沉默的细胞过程, 小双股RNA靶向一个同源序列, 通过细胞核酶使之裂解[24]. 大约22 nt的siRNA导入哺乳动物细胞, 能够导致细胞mRNAs特异性地沉默, 而没有由长双股RNA激活所诱导的非特异性的干扰素反应, 这种方法已经在细胞培养中成功地用于HBV和HCV复制子RNA[25]. siRNA分子可以显著降低病毒特异性蛋白表达和RNA合成, 并且这些抗病毒作用非依赖于IFN. siRNA以及传统的基因治疗, 虽然是很有前途的治疗方法, 但在基因传递、稳定性、毒性、抗性以及安全性等方面仍有很多问题有待解决.
3.3 免疫调节治疗
免疫调节治疗的目的是刺激宿主HBV-感染细胞的免疫反应而清除病毒感染. IFN和胸腺肽[4-5]已经用于临床, 本文强调其他对治疗CHB有用的免疫调节药物. 白介素-12(IL-12)与白介素-18(IL-18)由活化的巨噬细胞和树突状细胞分泌. IL-12通过促进Th1细胞反应在调节免疫系统中发挥重要作用[26]. 在IL-12存在的情况下, IL-18能够作用于Th1细胞、NK细胞和树突状细胞, 诱导IFN的产生[26-27] . 在HBV转基因鼠的研究中表明, IL-12可能通过局部诱导淋巴细胞分泌IFN, IFN/和TNF而发挥间接抗病毒作用, 下调了肝内、外病毒的复制. 在应用IFN治疗患者中的观察表明, 在IFN-应答者中, IL-12以及IL-2, IFN-的水平明显高于无应答者[28]. 最近, IL-12在CHB中的I/II 期研究表明, 剂量0.25与0.5 g/kg, 治疗12 wk, 血清HBV DNA显著降低, 但是其总的抗病毒作用低于 IFN或LMV. 研究表明, 短期的IL-12治疗是安全的, 副反应与 IFN相似. 在转基因鼠的研究中, Kimura et al[27]表明IL-18通过IFN、IFN/介导的非细胞病理过程, 抑制了肝内HBV复制, 这些结果也说明IL-18能协同IL-12抑制HBV复制, 表明联合给予IL-18和IL-12对CHB是有治疗作用的.
在病毒感染中, 树突状细胞作为抗原递呈细胞, 对于刺激调节性免疫方面发挥重要作用. 他们刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞, 产生影响Th1/Th2免疫平衡的细胞因子[29]. 除了抗原递呈功能, 激活的成熟树突状细胞还能分泌许多Th1和Th2型细胞因子, 如IFN/, TNF, IL-1, IL-8和IL-12等. HBV感染时, 树突状细胞在影响Th1、Th2反应中的有关资料还很有限, 树突状细胞功能的损伤可能导致HBV慢性化[28-30]. 树突状细胞虽然是免疫反应的刺激子, 但另一方面他又能通过T-细胞无反应性或T细胞排除诱导免疫耐受性, 其介导的耐受性尚不完全了解, 而且这些细胞是否能够导致新生儿耐受而引起HBV感染持续尚需进一步探讨. 近年来, 树突状细胞在处理免疫反应的效应方面已有临床研究: 体外培养树突状细胞并用抗原(如重组肿瘤与病毒抗原)刺激, 然后自体回输, 作为几种临床实验的免疫治疗[31], 但树突状细胞在CHB免疫治疗中的作用尚不成熟, 应用合适的HBV蛋白激活树突状细胞、克服免疫耐受、诱导多种对HBV的特异性免疫需要深入研究[32-33].
目前, 长期抗病毒治疗所致HBV耐药株的出现以及治疗后较低的持续/长期应答率, 是HBV治疗中两个棘手问题, 也给我们提出了新的挑战. HBV发病机制的深入研究以及新免疫治疗方法的发现, 可能会提供一些有用的方法. 另外, 在CHB治疗中, 目前还不清楚是单独应用核苷/核苷酸类似物治疗, 还是应该在核苷/核苷酸类似物基础上加用免疫调节剂, 这需要进行深入的临床研究. 在将来的应用中, 也有可能进行三联药物治疗, 例如两种核苷/核苷酸类似物联合应用PEG-IFN等. 同时, 新的抗-HBV 药物的产生, 包括非核苷类似物, 例如病毒包装抑制剂、免疫治疗(如树突状细胞疫苗), 将来对CHB治疗可能会获得良效.
