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世界华人消化杂志. 2004-06-15; 12(6): 1470-1473
在线出版日期: 2004-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i6.1470
食管鳞癌FLIP表达与细胞凋亡相关
高思海, 潘铁成, 赵金平, 李军
高思海, 潘铁成, 赵金平, 李军, 华中科技大学同济医学院附属同济医院胸心外科 湖北省武汉市 430030
通讯作者: 高思海. 430030, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属同济医院胸心外科. gshai@tjh.tjmu.edu.cn
电话: 027-62300305
收稿日期: 2004-04-04
修回日期: 2004-04-10
接受日期: 2004-04-16
在线出版日期: 2004-06-15

目的: 探讨凋亡抑制蛋白FLIP在食管鳞癌组织中的表达及其与细胞凋亡的关系.

方法: 应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(S-P法), 检测FLIP在10例正常食管组织及96例食管鳞癌组织中的表达, 并应用TUNEL技术检测96例食管鳞癌的凋亡情况.

结果: FLIP在96例食管鳞癌组织中有72例表达阳性, 占75%. 高分化组(Ⅰ-Ⅱ级)及临床早期(Ⅰ-Ⅱ期)病例食管癌的FLIP表达阳性率为64%(32/50), 低分化组(Ⅲ-Ⅳ级)及临床晚期(Ⅲ-Ⅳ期)病例食管癌的FLIP表达阳性率为82.6%(38/46), 二者比较, 差异有显著性(P<0.05); FLIP表达阳性率与食管鳞癌的病理分级和临床分期呈正相关. FLIP在食管鳞癌组织中的表达水平与癌细胞凋亡指数(AI) 有明显相关性(P<0.05).

结论: FLIP的异常表达在食管鳞癌的发生发展中起重要作用, 其表达与食管鳞癌细胞凋亡密切相关.

关键词: N/A
引文著录: 高思海, 潘铁成, 赵金平, 李军. 食管鳞癌FLIP表达与细胞凋亡相关. 世界华人消化杂志 2004; 12(6): 1470-1473
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: April 4, 2004
Revised: April 10, 2004
Accepted: April 16, 2004
Published online: June 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

FLIP (FLICE inhibitory protein)是近年来发现的一种新的凋亡抑制蛋白, 在病毒、真核生物、哺乳动物等许多物种中广泛存在. FLIP在结构与序列上与目前细胞凋亡信号传导的"关键分子"caspase-8有很多相似之处, 且能抑制caspase-8结合到死亡诱导信号复合物(DISC)上, 从而阻断Fas介导的细胞凋亡信号传导[1-2]. 食管癌是常见的癌之一, 他的发生发展与细胞凋亡及某些基因的激活或失活有关[3-13]. FLIP在食管癌中是否表达, 目前国内外尚未见报道. 我们探讨细胞凋亡抑制蛋白FLIP在食管癌组织中的表达及其与细胞凋亡的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

选自我院1994/2003年经病理检查证实的食管鳞癌患者96例, 男76例, 女20例, 年龄46-72 (平均61.3岁), 无术前放化疗. 取活组织标本0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小, 用40 g/L甲醛固定, 石蜡包埋, 连续切片, 留1张行苏木素伊红(HE)染色复诊. TNM分期: Ⅱｂ期42例, Ⅲa期18例, Ⅲb期17例. 一抗兔抗人FLIPS/L多克隆抗体(H202)为美国Santa Cruz公司产品;SP免疫组化试剂盒为美国Zymed公司产品. TUNEL检测试剂盒购于北京中山生物技术有限公司. 另取10例正常食管组织作为对照.

1.2 方法

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法, 实验步骤按试剂盒说明书进行. 将已知的乳腺癌切片作为阳性对照, 用磷酸盐缓冲液代替一抗, 作为阴性对照, FLIP以胞质定位为主. 在组织切片中不显色为阴性(-), 胞核或胞质显示为淡黄至黄棕色者为阳性细胞标志. 将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级: 表达弱阳性(+), 即阳性细胞数<10%, 显色强度为淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色; 表达中度阳性(++), 即阳性细胞数及显色强度介于弱阳性与强阳性之间. 表达强阳性(+++), 即阳性细胞数>60%, 多数细胞呈黄至棕黄色染色. 所有阳性片均置于10×40倍镜下, 随机选取5个视野, 经HPIAS 1000图像分析系统分析, 计算出平均阳性单位pu (positive unit). pu = (Ga-Gb)/Gmax×100, Ga、Gb分别为待测结构a和背景b的平均灰度. 并按下列关系算出各标本阳性染色度 = pu×阳性面积百分比. 凋亡指数(apoptosis index, AI)的测定: 以细胞核内出现棕褐色颗粒为阳性染色, 即为凋亡细胞. 每张切片计数500个癌细胞, 其中凋亡细胞占细胞总数的百分数为AI值.

统计学处理 应用SPSS10.0统计分析软件包对数据进行处理, 采用χ2检验, 方差分析及Spearman等级相关检验.

2 结果
2.1 食管癌组织中FLIP的表达

在96例食管癌中有72例FLIP表达阳性, 占75%, 其染色为棕黄色颗粒, 定位于细胞质内(图1A), 染色强度与食管癌病理分级呈正相关(图1B, 表1, P<0.05). 高分化组(Ⅰ-Ⅱ级)及临床早期(Ⅰ-Ⅱ期)病例食管癌的FLIP表达阳性率为64%(32/50), 低分化组(Ⅲ-Ⅳ级)及临床晚期(Ⅲ-Ⅳ期)病例为82.6%(38/46), 二者比较, 差异有显著性(表1, P<0.05).

表1 食管鳞癌FLIP表达与病理分级及细胞凋亡指数(AI)的关系.
分级nFLIPa
AI
-++++++%%
正常组织1010000019.2±1.7
Ⅰ级19923552.614.5±1.2
Ⅱ级31967970.911.3±1.1
Ⅲ-Ⅳ级4689101982.69.2±0.8
aP<0.05, 各级间比较.
图1
图1 食管鳞癌细胞胞质中FLIP蛋白表达 SP×400. A: 病理Ⅱ级; B: 病理IV级.
2.2 FLIP表达与癌细胞凋亡指数(AI)的关系

随肿瘤病理分级期升高, 食管鳞癌组织中FLIP蛋白表达阳性率逐渐升高, AI值逐步降低, 采用Spearman等级相关检验, 二者呈负相关(P<0.05). FLIP表达阳性率与食管鳞癌细胞凋亡密切相关(表1).

3 讨论

FLIP是近年来发现的一类含有死亡效应结构域(death effect domains, DED)的凋亡抑制蛋白, 首先在病毒中被发现. 这种蛋白在结构上与FLICE(FADD like IL-1 beta converting enzyme, caspase-8 )相似, 并能抑制FLICE的作用, 故他命名为FLIP, 因他来源于病毒, 所以又称为vFLIP. 人类FLIP基因含13个外显子, 与caspase-8基因均位于染色体的2q33-34, 二者相距约200 bp[14-17]. FLIP蛋白在结构与序列上也与caspase-8有很多相似之处, 其Ｎ端含有与caspase-8相似的两个相互串联的DED. 每个DED含有40个氨基酸, DED与Fas的死亡结构域(death domain, DD)的功能相似, 能介导蛋白质之间的相互结合, 可竞争性地与caspase-8上的DED结合, 阻断死亡信号复合体形成, 从而抑制凋亡[18-20]. FLIP的过量表达在肿瘤的发生中起重要作用. 有报道FLIP在胰腺癌[21]、胃癌[22]、肾癌[23]等肿瘤中过量表达. 我们发现FLIP过量表达与食管鳞癌的发生有关. 这可能是细胞癌变中的重要环节, 即细胞内染色体异常改变, 使FLIP基因激活并过度转录表达, FLIP蛋白增多则进一步促进细胞恶化. 我们进一步检测了FLIP与食管鳞癌临床病理特征的关系, 发现FLIP染色强度随食管鳞癌病理分级增高而增高, 高分化组(Ⅰ-Ⅱ级)及临床早期(Ⅰ-Ⅱ期)病例食管癌的FLIP表达阳性率为64%(32/50), 低分化组(Ⅲ-Ⅳ级)及临床晚期(Ⅲ-Ⅳ期)病例食管癌的FLIP表达阳性率为82.6%(38/46), 二者比较, 差异有显著性(P<0.05). 因而推论FLIP在食管鳞癌进展中也发挥着重要作用. 为了进一步研究FLIP在食管鳞癌中的凋亡抑制作用, 我们分析了染色强度与凋亡指数之间的相关性, 发现二者呈负相关. 结果显示FLIP可能通过抑制食管鳞癌细胞凋亡参与食管鳞癌的发生发展.

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