基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-06-15; 12(6): 1349-1352
在线出版日期: 2004-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i6.1349
鼠CD40配体基因的克隆及表达
蒋永芳, 苏先狮, 龚国忠, 何艳, 许允
蒋永芳, 苏先狮, 龚国忠, 何艳, 许允, 中南大学湘雅二医院肝病研究中心 湖南省长沙市 410011
蒋永芳, 男, 1972-10-29, 湖南省衡山县人, 汉族, 1995年湖南医科大学本科毕业, 2003年中南大学博士研究生毕业, 主治医师, 主要从事肝癌基因治疗的研究, 发表论文5篇.
基金项目: 湖南省卫生厅科研基金资助, No. Y02-42.
通讯作者: 蒋永芳, 410011, 湖南省长沙市, 中南大学湘雅二医院肝病研究中心. jiangyongfang@hotmail.com
电话: 0731-5524222-2263
收稿日期: 2004-03-05
修回日期: 2004-03-14
接受日期: 2004-03-18
在线出版日期: 2004-06-15

目的: 克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因, 为进一步研究打下基础.

方法: 用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段, 定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中, 重组质粒用脂质体转染H22细胞, G418筛选抗性细胞, 用RT-PCR检测目的基因的插入, 间接免疫荧光检测目的基因的表达.

结果: 含mCD40L基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后, 转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞, 经RT-PCR鉴定有含目的基因, 间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达.

结论: 成功克隆mCD40 L基因并在真核细胞得到有效表达.

关键词: N/A
引文著录: 蒋永芳, 苏先狮, 龚国忠, 何艳, 许允. 鼠CD40配体基因的克隆及表达. 世界华人消化杂志 2004; 12(6): 1349-1352
Cloning and expression of murine CD40 ligand gene
Yong-Fang Jiang, Xian-Shi Su, Guo-Zhong Gong, Yan He, Yun Xu
Yong-Fang Jiang, Xian-Shi Su, Guo-Zhong Gong, Yan He, Yun Xu, Center for Liver Disease, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
Supported by: the Public Health Department Foundation of Hunan Province, China, No. Y02-42.
Correspondence to: Dr. Yong-Fang Jiang, Center for Liver Disease, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China. jiangyongfang@hotmail.com
Received: March 5, 2004
Revised: March 14, 2004
Accepted: March 18, 2004
Published online: June 15, 2004

AIM: To study sub-cloning and expression of murine CD40 ligand (mCD40L) gene in eukaryotic cells as a basis for further study.

METHODS: The mCD40L gene fragment was amplified by using RT-PCR and sub-cloned into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1+, then transfected into H22 cell with Lipofectamine. After 2-3 weeks selection with G418, DNA was extracted from infected cells and tested by RT-PCR, indirect immunofulorescence were used to detect the expression of mCD40 L.

RESULTS: The insertion mCD40L gene fragment in the eukaryotic expression plasmid was confirmed by enzyme digestion with EcoR I and Nhe I and sequence analysis. The result RT-PCR showed that mCD40L gene had been integrated into the genome of infected H22 cells. Indirect immunofulorescence analysis showed that mCD40L had been expressed in these cells.

CONCLUSION: The mCD40L gene is integrated into eukaryotic cells with eukaryotic expression plasmid and target gene is expressed efficiently.

Key Words: N/A
0 引言

CD40配体(CD40L)是分子质量为39 kd的糖蛋白, 在淋巴细胞和非淋巴细胞表面均有表达, 属肿瘤坏死因子家族中的一员, 可与抗原提呈细胞(APC)上的CD40结合. CD40-CD40L相互作用在激活APC及激发细胞免疫和体液免疫方面起重要作用[1]. 通过转导CD40L基因有可能成为治疗恶性肿瘤的一种有效的方法. 我们构建鼠CD40配体(mCD40L)基因真核表达载体及其表达, 为进一步研究打下基础.

1 材料和方法
1.1 材料

真核表达载体pcDNA3.1+, 带有强有力的巨细胞病毒CMV增强启动子, 能高效表达插入的目的基因, 含SV40启动子, 控制G418抗性基因的表达, 购于美国Promega公司; 大肠杆菌JM109, 购于美国Promega公司; Balb/C小鼠肝癌细胞株H22细胞购自武汉大学典型物保存中心; 修饰酶、连接酶和质粒回收试剂盒购自Promega公司; 限制性内切酶NheI和EcoRI分别购自大连宝生物有限公司和华美生物工程公司; DNA分子量标准(1 031 bp), MBI产品; PCR纯化试剂盒, 美国QIAGEN公司产品; RPMI1640培养基和G418购自美国Gibico公司; 脂质体转染剂 Lipofectamine PlusTM Reagent购自美国Invitrogen公司; SABC-FITC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司. 根据mCD40L基因序列及载体要求, 我们设计扩增的引物序列分别为: 5'-GAC GCT AGC ATG ATA GAA ACA TAC AGC CAA CCT-3'和5'-GCC GAA TTC TCA GAG TTT GAG TAA GCC AAA AGA-3', 在引物的两端分别含有NheI和EcoRI酶切位点, 由上海生工合成.

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR扩增mCD40L cDNA: 从Balb/c 小鼠的脾细胞提取细胞总的RNA后, 以Oligod(T)18合成第一链cDNA, 作为PCR模板, 用PCR法扩增鼠CD40L基因, 反应条件为: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 60 s、60 ℃ 50 s、72 ℃ 90 s 共35个循环, 72 ℃ 10 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增带, 并用PCR纯化试剂盒回收特异PCR扩增片段.

1.2.2 表达重组体的构建及鉴定: 先用T-A克隆将PCR产物和pUCm-T载体连接, 构建中间重组体(pUCm-T-mCD40L), 经酶切鉴定和序列分析后. 将pUCm-T-mCD40L和真核表达载体pcDNA3.1+均分别用NheI和EcoRI酶进行消化, 回收目的片段. 将含NheI和EcoRI两粘端的PCR产物定向亚克隆于含与之相匹配两粘端的pcDNA3.1+, 构建成真核表达重组体(pcDNA3.1+-mCD40L cDNA ). 通过NheI和EcoRI双酶切和序列分析进行鉴定.

1.2.3 质粒转染小鼠肝癌细胞株H22及筛选: 常规复苏H22细胞, 适时传代, 细胞增生至足量后按2.5×105个细胞/孔的浓度接种六孔板中, 按脂质体转染Lipofectamine PlusTM Reagent试剂盒说明书进行, 简述如下, 4 mL脂质体和4 mg重组质粒混合, 放置15 min后加到有H22细胞的六孔培养板中, 37 ℃ 50 mL/L CO2的培养箱中孵育3 h后, 改用200 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养, 转染后4 d后, 细胞1:20传代, 改用含G418的选择培养基进行筛选(G418浓度前2 d为250 mg/L, 3-4 d为500 mg/L, 以后为800 mg/L), 隔日换液, 一共选择培养18 d, 至阴性对照孔细胞全部死亡后恢复普通培养.

1.2.4 mCD40L在真核细胞中的表达: 将抗性H22细胞扩增培养后, 提取细胞RNA, 按前面的反应体系和反应条件, 用RT-PCR方法检测目的基因. H22细胞涂片后, 用间接免疫荧光法检测mCD40L的表达(按SABC-FITC试剂盒操作指南).

2 结果
2.1 RT-PCR扩增mCD40L 基因

以总RNA作为模板, 18聚T寡核苷酸作引物合成cDNA第一链, 然后用特异引物进行PCR扩增, 能顺利扩增出大小约783 bp的条带(图1).

图1
图1 鼠CD40配体RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳. 1: 目的产物; 2: DNA分子量标准(1 031 bp); 3: 阳性对照(β-actin).
2.2 表达重组体的构建及鉴定

中间重组体(pUCm-T-mCD40L) 经酶切鉴定和序列分析证明正确后, 用NheI和EcoRI酶切将PCR产物定向亚克隆于表达质粒pcDNA3.1+中, 构建表达重组体(pcDNA3.1+-mCD40L), 将pcDNA3.1+-mCD40LcDNA用NheI和EcoRI双酶切, 可获得两个片段, 小片段与PCR产物一致(图2). 重组质粒经测序证实有包括起使密码子和终止密码子在内的完整的mCD40L基因片段插入pcDNA3.1+载体中(图3).

图2
图2 鼠CD40配体真核表达质粒双酶切鉴定结果. 1: DNA分子量标准(2 000 bp); 2: RT-PCR产物; 3: pcDNA3.1+-mCD40L经NheI和EcoRI双酶切; 4: pcDNA3.1+-mCD40L未酶切; 5:DNA分子量标准(10 000 bp).
图3
图3 重组质粒序列测定结果. 测序结果表明包括起始密码子和终止密码子在内的完整的mCD40L基因插入表达质粒中.
2.3 目的基因在真核细胞中的表达

逆转录PCR检测到mCD40L在H22细胞中表达(图4); 用间接免疫荧光法检测到用pcDNA3.1+-mCD40L转染后的H22细胞中荧光染色阳性, 证明有mCD40L的表达(图5).

图4
图4 RT-PCR检测鼠CD40配体基因在H22细胞中的表达. 1: 8: DNA分子量标准(分别为2 000 bp和1 031 bp); 2: 空白载体转染H22细胞RT-PCR结果; 3-6: 重组质粒转染H22细胞RT-PCR结果; 7:鼠脾细胞RT-PCR结果.
图5
图5 间接免疫荧光检测H22细胞中鼠CD40配体的表达. 有鼠CD40配体表达的H22细胞, 荧光染色呈阳性.
3 讨论

肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一[2-3], 由于肝细胞癌对于各种治疗方法的疗效均很差, 且易转移, 使之成为治疗上最困难的肿瘤之一[4]. 所以急需寻找新的治疗方法, 近年来随着分子生物学的飞速发展, 免疫基因治疗被认为是一种很有前途的治疗方法[5]. 在免疫基因治疗研究方面, 选择有效的目的基因至关重要. CD40配体(CD40L), 又称作CD154, 属于肿瘤坏死因子基因超家族中的一员, 在激活的T细胞等多种细胞表面均有CD40L的表达, 同样包括B细胞和多种肿瘤细胞在内细胞表面有CD40分子的表达, CD40L和CD40相互作用, 能激活B细胞和前凝血质, 促进黏附因子、细胞因子、化学因子和MMP的释放[1]. 其实质是诱发体液免疫和细胞介导的免疫反应. 正由于CD40L/CD40相互作用所具有的多种生物学活性, 将外源目的基因CD40L基因导入机体内, 可能产生强烈的抗肿瘤免疫反应, 而将CD40L基因联合其他免疫治疗基因(如IL-12, CD80等)或肿瘤相关抗原(如AFP)疗效可能更好[6]. 利用鼠CD40L基因已开展了许多抗肿瘤免疫方面的研究, 治疗策略包括有: 用CD40L基因或者联合IL-12基因转染白血病细胞, 再把这些细胞注入机体内治疗急性白血病[7]和慢性B淋巴细胞性白血病[8]等, 能诱导明显的抗白血病免疫反应; 利用一定的载体将鼠CD40L基因导入荷瘤动物体内治疗肺癌[9-10]、结肠癌[11]、膀胱癌[12-15]肝癌[16-17]、胸膜间皮瘤[18]、胃癌[19]和黑色素瘤[20]等, 结果表明鼠CD40L基因均能激活T细胞、上调IL-12等细胞因子水平和增加NK细胞活力等保护性免疫反应和增加癌细胞凋亡, 从而使荷瘤鼠的瘤结节退化, 能持久抑制再次注入的癌细胞的生长, 动物存活期延长; 由于CD40L转染DC细胞后能促进DC细胞成熟和分泌IL-12[21-22], 所以通过转染CD40L基因制备DC瘤苗同样可以治疗肿瘤; 自体T细胞经巨噬细胞集落刺激因子和IL-4刺激后, CD40L分泌增多, 这样联合DC细胞和激活后的自体T细胞成为癌症免疫基因治疗的一种新的方法[23]. CD40L基因的治疗策略为癌症的基因治疗开辟一条新的途径. 我们以鼠脾细胞总RNA为模板, 用RT-PCR方法, 成功扩增出了特异的mCD40L基因, DNA序列测定表明, 所扩增的片段的确是mCD40L基因片段, 与国外报道的基因序列完全一致. 在此基础上, 成功构建了真核表达重组体pcDNA3.1+-mCD40L, 重组质粒转染真核细胞后, 检测到有mCD40L的表达, mCD40L真核表达载体的构建和有效表达, 为下一步研究其生物学活性和免疫基因治疗肝癌打下了良好的基础.

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