幽门螺杆菌对人肝细胞系HepG2细胞蛋白质组的影响

摘要

目的: 初步观察H. pylori对人肝细胞系HepG2蛋白质的差异表达, 为进一步探讨H. pylori对肝细胞的病理作用机制奠定基础.

方法: 将H. pylori与HepG2共同培养6 h, 采用双向电泳技术, 对H. pylori处理和未处理HepG2细胞蛋白质进行分离和比较分析.

结果: 图像分析探测到H. pylori处理前后HepG2 2-DE图谱的平均蛋白质点数分别为988±94个、996±68个, 蛋白质点的匹配率为86.4%. 发现对照和H. pylori处理HepG2蛋白表达有明显差异, 主要是蛋白表达量的增加和减少, 其中在H. pylori处理后有10种蛋白(M_r/pI:91 326/6.21, 90 640/6.68, 87 833/5.65, 81 139 /6.55, 63 805/6.24, 60 445/7.38, 47 592/5.28, 46 293/7.21, 43 415/7.64, 21 704/5.66)表达增强, 8种蛋白(M_r/pI: 70 839/7.02, 56 403/6.58, 44 076/6.86, 43 744/7.21, 42 497/6.64, 37 567/7.17, 22 342/7.49, 21 112/5.63)表达降低.

结论: H. pylori处理前后HepG2的蛋白质组具有差异, 这些差异表达的蛋白质可能参与了H. pylori对肝细胞的病理作用过程, 这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究H. pylori与人类肝脏疾病的关系.

关键词: N/A

Effect of Helicobacter pylori on HepG2 proteome

Yan Zhang, Xue-Gong Fan, Ren Chen, Jian-Ping Liu, Ning Li

Yan Zhang, Xue-Gong Fan, Ren Chen, Ning Li, Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Jian-Ping Liu, Analytical Testing Center, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410078, Hunan Province, China

Correspondence to: Xue-Gong Fan, Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China. xgfan@hotmail.com

Received: January 15, 2004
Revised: February 9, 2004
Accepted: March 4, 2004
Published online: June 15, 2004

Abstract

AIM: To further explore the pathological effect mechanism of H. pylori on human hepatoma cells, and to analyze the differences on the protein expression in HepG2 induced by H. pylori preliminarily.

METHODS: H. pylori was co-cultured with HepG2 for 6 h. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE) was used to screen protein patterns of control and H. pylori-treated HepG2 for quantitative and qualitative analyses in protein expression.

RESULTS: 988 94 spots were detected in control HepG2 cells and 996 68 spots were detected in H. pylori-treated HepG2 cells. A match rate 86.4% was achieved. The results also showed that 18 proteins spots displayed quantitative changes in expression after H. pylori treatment (P < 0.05),of which, 10 (M_r/pI: 91 326/6.21, 90 640/6.68, 87 833/5.65, 81 139 /6.55, 63 805/6.24, 60 445/7.38, 47 592/5.28, 46 293/7.21, 43 415/7.64, 21 704/5.66) were enhanced in abundance and 8 (M_r/pI: 70 839/7.02, 56 403/6.58, 44 076/6.86, 43 744/7.21, 42 497/6.64, 37 567/7.17, 22 342/7.49, 21 112/5.63) showed lower expression.

CONCLUSION: There is a significant difference at protein level between control and H. pylori-treated HepG2. These proteins may be involved in the pathological process of H. pylori on HepG2. It suggests that the differential expression analysis of proteomes may be useful to further study of the relation of H. pylori and human liver diseases.

Key Words: N/A

0 引言

近年的许多研究表明, 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)除引起胃肠疾病外, 还与人类某些肝脏疾病的发生相关[1-22].本课题组前期的研究工作证实, 肝癌患者肝组织存在螺杆菌感染, 通过测序表明, 该螺杆菌16S rDNA与H. pylori 16S rDNA具有99%的同源性[23-25].我们近期的研究结果亦表明, cagA⁺H. pylori与体外肝细胞共培养时可引起肝细胞系HepG2细胞周期素D1(cyclin D1)、增生细胞核抗原(PCNA)和c-fos原癌基因的表达增加. 为了进一步探讨H. pylori对肝细胞的病理作用, 我们应用高信息量、高分辨率的蛋白质组学技术, 观察H. pylori处理后HepG2细胞蛋白质表达谱的变化, 通过对差异表达蛋白质的分析, 为进一步阐明H. pylori在肝脏疾病发生、发展中的可能作用提供理论和实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

人肝细胞系HepG2购自上海细胞生物研究所, H. pylori标准株ATCC49503(cagA+)为本室保存[26]. 固相pH梯度干胶条(IPGstrip pH3-10L, 18 cm)、IPG缓冲液(pH3-10L)、覆盖液均为Pharmacia公司产品; 二硫苏糖醇(DTT)、硫脲、碘乙酰胺均为Sigma公司产品; 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、硝酸银、硫代硫酸钠均为Amresco公司产品; 低M_r标准蛋白质购自上海伯奥生物制品公司.所有溶液均用双蒸水配制. IPGphor等电聚焦仪(Pharmacia公司); ProTEANⅡ垂直电泳槽、MODEL 1000/5000电泳仪、GelDoc2000凝胶扫描仪(Bio-Rad公司); ImageMaster 2D Elite(3.01版)分析软件(Pharmacia公司).

1.2 方法

HepG2细胞采用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃, 50 mL/L CO₂温箱传代培养, 取对数生长期细胞进行实验.H. pylori菌株按我室建立的方法进行培养[27]. 3 d后收集细菌, 用0.01 moL/L PBS洗下菌落, 4 000 r/min×10 min离心沉淀, 沉淀重悬于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基(不加双抗), 调H. pylori 终浓度为1×10¹¹ CFU/L. H. pylori (2×10⁸CFU)加入细胞(2×10⁶)中, 使细菌与细胞数之比为100:1. 空白对照孔不加细菌, 只加含100 mL/L胎牛血清的DMEM, 共培养6 h后用胰酶消化收集细胞. 细胞沉淀中加入200 mL细胞裂解液(8 moL/L urea, 2 moL/L thiourea, 40 g/L CHAPS, 40 mmoL/L Tris, 65 mmoL/L DTT, 5 mmoL/L PMSF), 静置30 min, 15 000 r/min 4 ℃离心30 min, 上清液即为细胞总蛋白. 取少量上清液用Bradford法测定总蛋白质浓度, 其余样品冻存于-80 ℃备用. IPG-DALT主要按Gorg et al[28]的方法和IPGphor等电聚焦系统指南进行. 细胞总蛋白提取物(300 mg)与水化液(8 moL/L urea, 20 g/L CHAPS, 18 mmoL/L DTT, 5 mL/L IPG缓冲液pH3-10 L, 痕量溴酚蓝)充分混合, 总体积350 mL吸入IPGstrip持胶槽, 加入IPG干胶条, 覆盖一层矿物油以防样品液蒸发, 水化和等电聚焦在20 ℃自动进行, 总电压时间积为41 920 Vh. 等电聚焦结束后, IPG胶条在平衡液A (50 mmoL/L Tris-HCL pH8.8, 6 moL/L urea, 300 mL/L甘油, 20 g/L SDS, 2 g/L DTT, 痕量溴酚蓝)中平衡15 min, 后于平衡液B(以30 g/L碘乙酰胺替换2 g/L DTT)中平衡15 min.平衡好的胶条转移至0.75 mm厚的125 g/L的SDS-PAGE均匀分离胶顶端, 排除气泡后用10 g/L琼脂糖封固, 15 ℃循环水冷却, 先以20 mA/2块胶恒流电泳, 20 min后换用40 mA/2块胶恒流电泳, 溴酚蓝到达距胶底边1 cm处停止电泳. 银染按蛋白质银染操作手册进行[29]. 银染显色的凝胶通过GelDoc 2000凝胶成像系统获取图像, 用ImageMaster2D Elite(3.01版)分析软件对图像进行消减、斑点检测、匹配、量化、获取斑点位置坐标等分析. 斑点位置的重复性按Corbett et al[30]的方法进行计算.

统计学处理 所有数据的统计分析在SPSS for Windows 10.0软件和Excel上进行.

2 结果

2.1 双向电泳图谱及分辨率

3次重复结果统计显示, 对照可分辨蛋白质点为988±94个(图1A), H. pylori处理组可分辨蛋白质点为996±68个(图1B). 这些蛋白质等电点和Mr分布范围较广, 但主要分布在等电点为4-8, Mr为31 000-97 000道尔顿(Da)的范围.以A胶为参考胶, B胶与之匹配, 其匹配率为86.4%, 图2为A, B胶的匹配图. 任意选取20个在对照和H. pylori处理组凝胶图谱中相互匹配、分辨清楚的蛋白质点进行位置重复性分析, 发现IEF方向的平均偏差为(2.82±0.13 mm), SDS-PAGE方向的平均偏差为(2.97±0.34 mm), 表明蛋白质点在位置上具有较好的重复性. 以上条件能满足两组细胞间的差异蛋白质分析.

图1 对照HepG2. A: 与H. pylori处理HepG2; B: 蛋白双向电泳图.

图2 A, B胶匹配图(红色和蓝色圆圈分别代表图1A和图1B上的蛋白质点).

2.2 蛋白质组的表达变化

通过ImageMaster2D Elite软件匹配分析, 发现10种蛋白在H. pylori处理后表达水平明显升高(图1A中标号为1-10的蛋白质点), 8种蛋白在H. pylori处理后表达水平明显下降(图1A中标号为A-H的蛋白质点), 部分差异蛋白点的放大图谱如图3; 差异蛋白点的等电点、M_r和蛋白增减量详见表1, 2.

表1 H. pylori处理后表达增强的蛋白质点.

点号	等电点(pI)	分子量(Mr/Da)	增加量(%)
1	6.21	91 326	158.42
2	6.68	90 640	437.10
3	5.65	87 833	211.37
4	6.55	81 139	30.62
5	6.24	63 805	161.79
6	7.38	60 445	720.60
7	5.28	47 592	135.66
8	7.21	46 293	136.23
9	7.64	43 415	1 177.77
10	5.66	21 704	209.68

表2 H. pylori处理后表达减弱的蛋白质点.

点号	等电点(pI)	分子量(Mr/Da)	减少量(%)
A	7.02	70 839	86.15
B	6.58	56 403	90.31
C	6.86	44 076	77.92
D	7.21	43 744	70.37
E	6.64	42 497	70.95
F	7.17	37 567	74.19
G	7.49	22 342	70.23
H	5.63	21 112	83.56

图3 部分差异蛋白质点的放大图谱. A: 对照HepG2; B: H. pylori处理HepG2(箭头所示为与A图中相对应的蛋白质点).

3 讨论

HepG2细胞来源于人肝胚胎瘤细胞, 具备人肝细胞绝大多数的生物学功能和生化功能特征. 与人肝细胞相比, HepG2细胞更容易获得, 并能传代培养, 因此常用其替代肝细胞作相关研究[31].

近年来蛋白质组学技术飞速发展, 高通量、高灵敏性和高分辨率的分离与分离后鉴定技术, 加之准确而全面的数据库, 使蛋白质组学技术在生物医学的研究中发挥着十分重要的作用[32]. 运用蛋白质组的研究手段, 通过比较正常、病理状态下和给予药物后组织或细胞中蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异, 则可发现与这种病理状态相关的蛋白质、疾病的特异蛋白质, 探索药物作用的蛋白靶点[33-37].

当今用于蛋白质组研究的主要技术是固相pH梯度等电聚焦双向凝胶电泳技术[28,38]. 重复性问题是双向凝胶电泳中的关键问题, 从细胞培养、样品制备、双向电泳到染色显影, 其中任何一个环节都有可能造成蛋白斑点的量及其在胶中位置的变化, 从而可能造成一些蛋白斑点的不匹配, 因而在这些过程中应尽量保持其同一性.我们通过反复实践与摸索, 已成功地建立了分辨率高、重复性好的固相pH梯度双向凝胶电泳方法[39], 为本实验进行H. pylori处理HepG2与对照HepG2细胞间的蛋白质组差异分析提供了有利的条件. 通过对银染图像严格的图像分析及处理(图像获取、背景消减、斑点识别及斑点匹配等), ImageMaster2D Elite软件匹配分析显示, 两组细胞的蛋白质谱中大部分的蛋白质表达无明显差异, 其匹配率平均为86.4%, 尚有14%左右的点不能匹配. 我们发现HepG2细胞在用H. pylori处理后其蛋白表达有不少差异点出现, 其中至少有18种蛋白质发生了明显和稳定的量的改变(P<0.05). 这些差异蛋白质可能参与了H. pylori对肝细胞的病理作用过程. 这些蛋白的Mr和等电点已经初步确定, 但他们是已知结构蛋白还是尚未发现的新蛋白, 还需进行进一步地识别和确认, 包括质谱鉴定、氨基酸序列分析以及上网数据库查询等. 我们前期的研究表明, cagA⁺H. pylori可以引起HepG2细胞细胞周期素D1(cyclin D1)、增生细胞核抗原(PCNA)和原癌基因c-fos的表达异常, 此项实验中所呈现的差异蛋白是否为上述与细胞周期、细胞增生以及细胞癌变有关的蛋白, 以及H. pylori作用于细胞后怎样导致这些蛋白质的改变尚有待进一步研究.

备注

$[Footnotes]

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