病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-06-15; 12(6): 1292-1294
在线出版日期: 2004-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i6.1292
复方肝癌宁抗乙型肝炎病毒的体外实验研究
袁冬生, 王新华, 李常青, 肖会泉
袁冬生, 广州中医药大学职业技术学院 广东省广州市 510405
王新华, 广州中医药大学国际学院 广东省广州市 510405
李常青, 广州中医药大学热带医学研究所 广东省广州市 510405
肖会泉, 广州中医药大学第一附属医院 广东省广州市 510405
袁冬生, 男, 1964-10-02生, 江西省乐安县人, 汉族, 副教授.
通讯作者: 袁冬生, 510405, 广东省广州市, 广州中医药大学职业技术学院. ydshy@21cn.com
电话: 020-36585519 传真: 020-36585521
收稿日期: 2003-12-29
修回日期: 2004-01-19
接受日期: 2004-02-18
在线出版日期: 2004-06-15

目的: 探讨复方肝癌宁体外抗乙肝病毒(HBV)作用.

方法: 通过复方肝癌宁作用于体外培养的2.2.15细胞, 观察复方肝癌宁对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响及药物的细胞毒性作用.

结果: 复方肝癌宁作用于2.2.15细胞8 d后, 对细胞的半数毒性浓度(TC50)为大于10 g/L, 对HBsAg和HBeAg抑制的半数有效浓度(IC50)分别为0.67 g/L和0.13 g/L, 复方肝癌宁对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别为14.93和76.92.

结论: 复方肝癌宁在体外细胞培养中对HBsAg和HBeAg的分泌有较好的抑制作用, 有显著的抗HBV作用.

关键词: N/A
引文著录: 袁冬生, 王新华, 李常青, 肖会泉. 复方肝癌宁抗乙型肝炎病毒的体外实验研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(6): 1292-1294
Anti-HBV effect of compound Ganaining in vitro
Dong-Sheng Yuan, Xin-Hua Wang, Chang-Qing Li, Hui-Quan Xiao
Dong-Sheng Yuan, Professional Technology College, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Xin-Hua Wang, International College, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Chang-Qing Li, Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Hui-Quan Xiao, First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Correspondence to: Dong-Sheng Yuan, Professional Technology College, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China. ydshy@21cn.com
Received: December 29, 2003
Revised: January 19, 2004
Accepted: February 18, 2004
Published online: June 15, 2004

AIM: To study the anti-HBV effect of compound Ganaining in vitro.

METHODS: The 2.2.15 cell line was cultured in vitro to observe the inhibitory effect of compound Ganaining on secretion of HBsAg and HBeAg, and its toxicity on 2.2.15 cell line was also studied.

RESULTS: After the addition of compound Ganaining in 2.2.15 cell line for eight days, it showed that median toxic concentration (TC50) of compound Ganaining was more than 10 g/L. IC50 of compound Ganaining on HBsAg and HBeAg was 0.67g/L, and 0.13g/L, respectively; its treatment index (TI) value on HBsAg and HBeAg was 93.46 and 2.17, respectively.

CONCLUSION: Compound Ganaining has a strong inhibitory action on secretion of HBsAg and HBeAg, and shows good effect of anti-HBV in 2.2.15 cell line.

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)感染会导致急慢性乙型肝炎的发生, 而且与原发性肝癌关系密切. 近十多年来抗HBV的药物研究虽然取得了一定的进展, 但目前仍缺乏比较理想的治疗药物, 因此寻找新的有效药物显得尤为必要. 2.2.15细胞株是用共转染法将克隆的HBV-DNA和抗G418质粒同时转入人肝癌细胞株HepG2而建立, 能长期稳定地分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒, 是目前体外抗HBV药物筛选和评价较好的细胞模型[1-6]. 本实验研究以2.2.15细胞株为模型, 研究证实了复方肝癌宁的体外抗HBV作用.

1 材料和方法

2.2.15细胞(自HepG2细胞转染而来, 分泌HBsAg, HBeAg): 引自广州空军医院病毒室, 用DMEM培养液(GIBCO), 培养液加10%胎牛血清(天津血液所), 100 mg/L青霉素, 100 mg/L链霉素, G418 380 mg/L (GIBCO ), 0.3 g/L谷氨酰氨, 用2.38 g/L Hepes调pH至6.8. 用0.6 g/L 胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成 3×107/L, 每孔0.1 mL/于96孔板, 2 d后换用含药培养液, 每个浓度加4孔, 复方肝癌宁用细胞维持液稀释成(10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156, 0.078 g/L), 与细胞作用8 d后, 吸上清用ELISA法测定HBsAg, HBeAg, 余下细胞用甲基噻唑基四唑(MTT)法测定药物细胞毒性, 向细胞加入400 mg/L MTT 0.1 mL/孔(Sigma ), 37 ℃、50 mL/L CO2培养箱孵育4 h后, 可见黄黑色甲瓒颗粒, 轻轻弃去MTT液, 加入1 kg/LDMSO 0.1 mL/孔, 37 ℃、50 mL/L CO2培养箱内孵育, 待甲瓒颗粒完全溶解(约10 min)后, 用紫外分光光度计570 nm波长测定吸光度A值, 空白对照加4孔1 kg/L DMSO 0.1 mL/孔. 按下式计算细胞破坏百分率(%) = [(细胞对照A值-药物实验组A值)/(细胞对照A值-空白对照组A值)]×100%; 半数毒性浓度(TC50)TC50 = Antilog[B +(50-<50%破坏百分率)×C/(>50%破坏百分率-<50%破坏百分率)][7-8]; A = log>50%药物浓度; B = log<50%药物浓度; C = A-B. HBsAg、HBeAg的检测采用华美公司ELISA测定盒检测. 用酶标仪450/630nm双波长测定每孔A值, 并计算药物的半数有效浓度(IC50). 细胞抑制百分率(%) = [(细胞对照A值-药物实验组A值)/(细胞对照A值-空白对照组A值)]×100%; IC50 = Antilog[B +(50-<50%抑制百分率)×C/(>50%抑制百分率-<50%抑制百分率)][7-8]; A = log>50%药物浓度; B = log<50%药物浓度; C = A-B.

药物对HBsAg, HBeAg的抑制作用, 本实验选择HBsAg, HBeAg作为药物效果的筛选指标, 通过MTT法测定药物的细胞半数毒性浓度(TC50), 并相应计算出治疗指数(TI) = TC50/IC50[8]来评价药物临床应用前景, 其中TI>2为有效低毒, 1<TI<2为低效有毒, TI<1为毒性作用.

2 结果

MTT法测得复方肝癌宁在2.2.15细胞上半数毒性浓度(TC50)为>10 g/L. 复方肝癌宁在各个稀释浓度下对2.2.15细胞形态均有轻微的损坏, 个别细胞有破坏情况(最低浓度除外), 但细胞破坏率大小与细胞形态变化无明显直接关系, 且其数值均不超过46%, 即都在复方肝癌宁的半数毒性浓度以下(表1).

表1 复方肝癌宁对2.2.15细胞的毒性作用(mean±SD).
分组剂量(g/L)A值(mean±SD)破坏率(%)
空白对照0.00.010
细胞对照0.01.82±0.170
复方肝癌宁10.01.22±0.0434.68
5.01.03±0.1145.66
2.51.22±0.0834.68
1.251.30±0.0830.06
0.6251.04±0.0145.09
0.3 1251.15±0.1138.73
0.1561.196±0.0736.07
0.0781.78±0.192.31

复方肝癌宁抑制2.2.15细胞分泌HBsAg的半数有效浓度(IC50)为0.67 g/L , 即复方肝癌宁在本实验中浓度为0.625 g/L 以上抑制效果明显, 低于此浓度抑制效果不明显; 抑制2.2.15细胞分泌HBeAg的半数有效浓度(IC50)为0.13 g/L, 即复方肝癌宁在本实验中浓度为0.156 g/L以上抑制效果明显, 低于此浓度抑制效果不明显(表2).

表2 复方肝癌宁对2.2.15细胞分泌HBsAg, HBeAg的抑制作用.
分组剂量(g/L)HBsAg
HBeAg
A值(mean±SD)抑制率(%)A值(mean±SD)抑制率(%)
空白对照0.00.039-0.01
细胞对照0.00.59±0.121.71±0.56
复方肝癌宁10.00.26±0.0455.91.06±0.2038.0
5.00.19±0.0467.80.57±0.1266.7
2.50.23±0.0561.00.60±0.1264.9
1.250.25±0.0357.60.67±0.0960.8
0.6250.30±0.0649.20.77±0.1555.0
0.31250.28±0.0852.50.80±0.1953.2
0.1560.33±0.0544.10.81±0.2352.6
0.0780.44±0.0525.40.98±0.2042.7

复方肝癌宁对2.2.15细胞分泌HBsAg, HBeAg的治疗指数分别为14.93, 76.92, 远大于2, 具有较强的体外抑制2.2.15细胞表达乙肝病毒抗原的作用, 提示复方肝癌宁在体外实验中有很好的抗HBV作用.

3 讨论

2.2.15细胞株的建立, 为体外筛选抗病毒药物提供了较好的细胞模型. 抗病毒治疗的目的是持续抑制病毒复制, HBsAg 和HBeAg为2.2.15细胞分泌至上清液中的可溶性蛋白质, 间接地反映了病毒复制状况, 因检测简便、经济和快速, 可作为抗HBV筛选的可靠指标. MTT比色法主要原理在于检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的活力, 活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为蓝紫色结晶物并沉积在细胞中, 而死亡细胞无此功能, 它在一定程度上反映了细胞的生存活力, 以此数据换算得出TC50, 比传统方法在肉眼镜下观察和判断细胞破坏程度更客观、可信.

复方肝癌宁为纯中药复方制剂, 由叶下珠、青蒿、云芝、广豆根、莪术、菟丝子等组成. 研究表明该复方药物叶下珠[9-11]、青蒿[12-14]、广豆根[15-17]、莪术[18-20]均有较好的抗肝癌作用; 叶下珠[21-24]、广豆根[25-30]、云芝[31]有较好的抗乙肝病毒作用; 云芝[32-33]、广豆根[34]、青蒿[35]具有免疫调节作用. 本实验研究结果显示复方肝癌宁对2.2.15细胞的毒性较小, 细胞半数毒性浓度(TC50 )为>10 g/L, 对HBsAg和HBeAg抑制的半数有效浓度(IC50)分别为0.67 g/L和0.13 g/L, 其对HBsAg 和HBeAg的抑制作用, 与药物浓度呈正相关. 复方肝癌宁对HBsAg 和HBeAg 的治疗指数分别为14.93, 76.92, 均大于2, 提示复方肝癌宁为低毒有效的药物制剂.

2.2.15细胞培养具有易于控制实验条件及均衡性好等特点, 但体外实验研究结果不能反映体内所特有的免疫调节和体内代谢对药物效果的影响, 因此, 本实验研究虽然显示复方肝癌宁有较好的抑制HBsAg、HBeAg分泌作用, 但进一步证实其抗病毒作用还须结合体内实验来确定, 其作用机制也有待于进一步研究.

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