肝癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-06-15; 12(6): 1277-1279
在线出版日期: 2004-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i6.1277
a干扰素对人高转移肝癌细胞系HCCLM3血管形成因子表达的影响
赵铭锋, 王鲁, 许祖德, 赵燕, 汤钊猷
赵铭锋, 复旦大学附属华山医院外科病理室 上海市 200040
王鲁, 赵燕, 汤钊猷, 复旦大学中山医院肝癌研究所 上海市 200032
许祖德, 复旦大学上海医学院病理学系 上海市 200032
赵铭锋, 男, 1974-11-08生, 山东省滨州市人, 汉族, 2001年复旦大学附属华山医院病理学硕士
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30100077; 上海市科技发展基金资助项目, No. 03QD14008; 高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目, No. 200263.
通讯作者: 王鲁, 200032, 上海市医学院路136号, 复旦大学中山医院肝癌研究所. wlu@zshospital.net
电话: 021-54233058
收稿日期: 2003-12-10
修回日期: 2004-01-09
接受日期: 2004-02-09
在线出版日期: 2004-06-15

目的: 研究IFN-α对高转移潜能的人肝癌细胞系HCCLM3细胞血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和白介素-8(IL-8)表达的影响, 探索IFN-α抗肿瘤血管形成的机制.

方法: 将HCCLM3细胞在高糖DMEM培养液(Dulbecco's modified Eagle medium)和加入了不同剂量(30, 300或3 000 kU/L)IFN-α的DMEM培养液中孵育72 h. ELISA法检测IFN-α干预组与对照组(未加入IFN-α)中VEGF, bFGF, MMP-2, MMP-9和IL-8的表达情况.

结果: HCCLM3细胞空白对照组中VEGF, MMP-2, bFGF和IL-8的表达浓度分别为2 666±122.6, 4 400±1 000, 28.0±5.1和1 160±69.4 ng/L. 同时IFN-α为300 kU/L时, VEGF, MMP-2, bFGF和IL-8的浓度分别为2 476.5±125.7(P<0.05), 2 400±600(P<0.01), 25.8±1.6和1 079±5 ng/L; IFN-α为3 000 kU/L时, VEGF, MMP-2, bFGF和IL-8的浓度分别为2 289.5±119.5(P<0.01), 2 000±500 (P<0.01), 25.1±2.9和1 087.9±83.9 ng/L. 各组中均未检测到MMP-9的表达.

结论: IFN-α对HCCLM3细胞VEGF和MMP-2蛋白的表达均具有明显的抑制作用, 并呈剂量依赖性. bFGF, IL-8和MMP-9的表达浓度在IFN-α各剂量组与对照组间无显著性差别. IFN-α对肝癌细胞中VEGF和MMP-2表达水平的下调在其抗肝癌血管形成机制中发挥重要作用.

关键词: N/A
引文著录: 赵铭锋, 王鲁, 许祖德, 赵燕, 汤钊猷. a干扰素对人高转移肝癌细胞系HCCLM3血管形成因子表达的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(6): 1277-1279
Effects of IFN-α on expression of angiogenic factors in highly metastatic human hepatocellular carcinoma cell line HCCLM3 cells
Ming-Feng Zhao, Lu Wang, Zu-De Xu, Yan Zhao, Zhao-You Tang
Ming-Feng Zhao, Department of Surgical Pathology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
Lu Wang, Yan Zhao, Zhao-You Tang, Liver Cancer Institute and Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China.
Zu-De Xu, Department of Pathology, Fudan University, Shanghai 200032, China
Supported by: the Natural Scientific Foundation of China, No. 30100077.
Correspondence to: Wang Lu, Liver Cancer Institute and Zhongshan Hospital, Fudan University, 136 Yixueyuan Road, Shanghai 200032, China. wlu@zshospital.net
Received: December 10, 2003
Revised: January 9, 2004
Accepted: February 9, 2004
Published online: June 15, 2004

AIM: To study the effects of IFN-α on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and IL-8 in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line HCCLM3 cells and to explore the mechanism of antiangiogenic activity of IFN-α.

METHODS: The HCCLM3 cells were incubated for 72 h in high glucose Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) (GibocoBRL, NY) or the medium containing different doses of IFN-α (30, 300 or 3 000 kU/L). The concentrations of VEGF, bFGF, MMP-2, MMP-9 and IL-8 in cell culture supernatants were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

RESULTS: IFN-α treatment significantly decreased the expression of VEGF and MMP-2 in HCCLM3 cells. The concentrations of VEGF, MMP-2, bFGF, and IL-8 were 2 666.0±122.6, 4 400±1 000, 28.0±5.1 and 1 160.0±69.4 ng/L respectively in the control group, whereas those of VEGF, MMP-2, bFGF, and IL-8 were 2 476.5±125.7 (P < 0.05), 2 400±600 (P < 0.01), 25.8±1.6 and 1 079±5 ng/L when the concentration of IFN-α was 300 kU/L. But MMP-9 protein was not detected in all the groups.

CONCLUSION: IFN-α treatment significantly inhibits the expression of VEGF and MMP-2 in HCCLM3 cells in a dose-dependent manner. However, no significant difference is found in the levels of bFGF, IL-8 and MMP-9 among the control and the groups of different doses of INF-a ranging from 30-3 000 kU/L. The down-regulation of VEGF and MMP-2 levels contributes, at least in part, to the antiangiogenic activity of IFN-α.

Key Words: N/A
0 引言

肝癌在我国常见[1-2], 大剂量长疗程的IFN-α可剂量依赖性的抑制裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D20)肿瘤的转移复发和肿瘤生长, 临床随机对照临床试验也证实IFN-α可提高肝癌切除术后3年无瘤生存率10%[3]. 在裸鼠角膜接种LCI-D20肝癌组织后, 可诱导角膜形成新生血管, 应用IFN-α治疗后, 肿瘤血管形成受到明显抑制[4]; IFN-α还可有效的抑制血管内皮细胞的增生和迁移[4-5]. 这些结果提示抗肝癌血管形成是IFN-α作用的主要机制. 我们利用自发性肺转移人肝癌细胞系HCCLM3细胞, 检测IFN-α干预后血管形成因子VEGF, bFGF, MMP-2, MMP-9, IL-8的表达水平, 探索IFN-α的抗肝癌血管形成机制.

1 材料和方法
1.1 材料

使用复旦大学肝癌研究所建立的自发性肺转移人肝癌细胞系HCCLM3细胞[6]. IFN-α1b购自深圳科兴生物制品有限公司. VEGF, bFGF, MMP-9和IL-8 ELISA试剂盒购自R&D公司, MMP-2 ELISA试剂盒购自Oncogene公司.

1.2 方法

取1×106 HCCLM3细胞在25 cm2培养瓶中培养, 加高糖DMEM培养液(Giboco)7 mL, 在37 ℃, 50 mL/L CO2条件下, 培养6 h, 待细胞贴壁后分别加入剂量为30, 300, 3 000 kU/L的IFN-α并换液, 对照组中不加INF-a. 72 h后提取上清液, 1 000 g离心10 min, 去除所含微粒, 分装后贮存于-20 ℃待用. 血管形成因子表达量的测定采用夹心式酶联免疫测定技术(ELISA法), 试验步骤按说明书操作. 根据标准曲线计算各标本中5种细胞因子浓度值. 统计学处理 试验数据以均数±标准差(n = 5, mean±SD)表示, 采用SPSS11.5软件包One-Way ANOVA方法对资料进行统计分析, 两两比较采用最小显著性差数法(LSD). P<0.05为有统计学意义.

2 结果
2.1 上清液VEGF和bFGF蛋白浓度

对HCCLM3细胞培养72 h后的上清液进行ELISA法测定, 各IFN-α干预组(30, 300 和3 000 kU/L)VEGF蛋白浓度低于对照组. 其中300和3 000 kU/L组与对照组比较有显著性差别(P<0.05和P<0.01, 表1). IFN-α为30 kU/L时, VEGF浓度降低, 但没有显著性差别(P>0.05). 各IFN-α干预组(30, 300和3 000 kU/L)bFGF蛋白浓度与对照组比较略有降低, 但差别均没有显著性(P>0.05).

表1 上清中VEGF, bFGF蛋白的浓度(mean±SD ng/L).
IFN-α(kU/L)VEGFbFGF
对照组2 666.0±122.628.0±5.1
302 631.5±166.825.9±4.2
3002 476.5±125.7a25.8±1.6
3 0002 289.5±119.5b25.1±2.9
aP<0.05,
bP<0.01 vs 对照组.
2.2 上清液MMP-2, MMP-9和IL-8蛋白浓度

在IFN-α剂量为300, 3 000 kU/L时, HCCLM3细胞MMP-2的表达与对照组比较明显降低, 差别具有显著性 (P<0.01, 表2). IFN-α浓度为30 kU/L时MMP-2蛋白的表达亦有所降低, 但差别没有显著性(P>0.05). 在空白对照组和各IFN-α干预组中均未检测到MMP-9蛋白的表达. 在IFN-α剂量为300, 3 000 kU/L时, IL-8浓度与对照组比较略有降低, 但差别没有显著性(P>0.05).

表2 上清中MMP-2, IL-8蛋白表达(mean±SD ng/L).
IFN-α (kU/L)MMP-2IL-8
对照组4 400±1 0001 160.00±69.4
303 800±9001 167.57±28.0
3002 400±600b1 079.00±50.0
3 0002 000±500b1 087.86±83.9
bP<0.01 vs 对照组.
3 讨论

肿瘤血管生成是多种血管形成因子共同作用的结果[7-10]. 肝细胞癌(HCC)癌组织中VEGF蛋白和bFGF蛋白的表达水平与微血管密度(MVD)的增高密切相关(P<0.05, P = 0.0001), 并且二者在肿瘤血管形成中存在协同作用[11-13]. MMP-2和MMP-9在肿瘤组织中的表达水平与MVD的增高密切相关以及在肝细胞癌组织中与CD34表达呈正相关, 表明二者在促进肿瘤血管形成中也发挥重要作用[14-16]. IL-8可直接提高内皮细胞的生存能力, 促进内皮细胞增生并上调基质金属蛋白酶的表达, 进而调节血管生成[17]. HCC是典型的多血管肿瘤[18-19]. 抗肿瘤血管生成研究在抑制肝癌的转移复发及提高术后生存率方面均具有重要意义. von Marschallet al[20]证实IFN-α可通过Sp1-和(或)Sp3-转录因子抑制VEGF增强子的活性, 在转录水平上降低内分泌肿瘤细胞系中VEGF基因的表达. 在体内试验中IFN-α可降低肿瘤微血管密度、VEGF mRNA水平和血浆VEGF水平发挥抗血管形成活性. Slaton et al[21]研究表明IFN-α可下调人膀胱癌细胞(253J B-V IFN(R)细胞)中bFGF蛋白的表达水平.

我们既往研究证实, 在裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D20)大剂量(每日1.5×107及3×107 U/kg)长疗程(连续35 d)应用IFN-α, 肿瘤的肝内复发率、复发的病灶大小、肺转移率、MVD及血清VEGF水平均明显降低, 差别具有显著性(P<0.05), 而与对照组比较血清中bFGF水平差别无显著性(P>0.05)[22-23]. 我们证实在体外试验中, 大剂量的IFN-α可抑制自发性肺转移人肝癌细胞系HCCLM3细胞VEGF的表达, 并呈现剂量依赖性. 而对bFGF蛋白的表达水平无明显影响, 数据与前期试验相符. 但与Slaton的结论不一致, 可能与采用不同的细胞系有关.

此外, 我们还检测了IFN-α对HCCLM3细胞MMP-2, MMP-9的表达的影响, 结果首次证实大剂量的IFN-α可显著下调HCCLM3细胞MMP-2的表达水平. 而在各组中均未发现有MMP-9蛋白的表达. MMP-2在肿瘤的生长侵袭和转移过程中主要通过降解IV型胶原发挥作用[24-27]. IFN-α对HCCLM3细胞MMP-2表达的抑制作用说明在肿瘤血管形成和肿瘤细胞浸润两个层面上IFN-α均发挥作用. 而HCC中MMP-2 mRNA主要在肿瘤前沿浸润区的基质中表达, 有学者认为肿瘤细胞通过分泌细胞因子调节基质中巨噬细胞或成纤维细胞MMP-2的表达.

我们还检测到IFN-α对HCCLM3细胞IL-8的表达具有一定的抑制作用, 但数据显示差别未达到统计学意义. 本结果显示, 在体外培养试验中, IFN-α对HCCLM3细胞VEGF和MMP-2的表达均具有明显的抑制作用, 而对bFGF及IL-8的表达无明显影响.

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