ALA-PDT对SW480结肠癌细胞周期阻滞作用及对G1/S关卡调控因子的影响

摘要

目的: 了解光动力疗法对结肠癌SW480细胞的周期阻滞作用与G₁/S关卡调控因子之间的联系.

方法: 对体外培养的SW480结肠癌细胞进行ALA-PDT实验, 使用流式细胞仪技术观测基于δ-氨基乙酰丙酸的光动力疗法对SW480细胞的细胞周期阻滞作用, 应用免疫细胞化学技术检测光动力疗法对G₁/S关卡调 控 因 子Chk2, P21WAF1/Cip1/Sdi1, CyclinD1蛋白表达的影响.

结果: 基于δ-氨基乙酰丙酸的光动力疗法可在其作用后早期诱导SW480细胞产生G₀-G₁细胞周期阻滞, G₀/G₁期比例显著增加, 而S期和G₂/M期比例明显下降, 且呈时间依赖性变化; 光动力作用诱导SW480细胞G₁/S关卡调控因子Chk2, P21WAF1/Cip1/Sdi1蛋白表达增高, 降低CyclinD1蛋白表达, 与G₁/S期阻滞进程相一致, 均呈时间依赖性变化.

结论: 基于δ-氨基乙酰丙酸的光动力疗法可诱导SW480细胞产生G₀-G₁细胞周期阻滞, 光动力疗法对SW480细胞的G₀-G₁期阻滞作用与其对多个G₁/S关卡调控因子的调节事件有关.

关键词: N/A

Involvement of G₁/S checkpoint regulators during photodynamic-therapy-mediated cell cycle arrest in human colon carcinoma SW480 cells

Wei-Dong Xiao, Wei Chen, Hai-Yan Ge, Zu-Lin Chen

Wei-Dong Xiao, Hai-Yan Ge, Zu-Lin Chen, Department of General Surgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

Wei Chen, Department of Microbiology, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

Supported by: the National Natural Science Foundation of China, Nos. 30277829, 30200056.

Correspondence to: Dr. Zu-Lin Chen, Department of General Surgery, Xinqiao Hospital, Shapingba District, Chongqing 400037, China. chenzulin@163.com

Received: December 23, 2003
Revised: January 9, 2004
Accepted: January 15, 2004
Published online: May 15, 2004

Abstract

AIM: To investigate the involvement of G₁/S regulators during ALA-PDT-mediated cell cycle arrest.

METHODS: Colon carcinoma SW480 cells were treated with 1 mmol/L ALA and 6 h later irradiated with 9 J/cm² 631 nm light from a laser. The analysis of cell cycle arrest by ALA-PDT was performed by flow cytometry. The effect of ALA-PDT on G₁/S cell cycle regulators Chk2, CyclinD1 and P21WAF1/Cip1/Sdi1 was examined by using immunocytochemical technique.

RESULTS: ALA-PDT resulted in G₀-G₁ phase arrest of the tumor cell cycle in post-PDT in a time-dependent manner. Immunocytochemical analysis revealed that PDT resulted in an induction of G₁/S checkpoint regulation factors such as Chk2 and P21WAF1/Cip1/Sdi1, and a down-regulation of CyclinD1 in a time-dependent manner.

CONCLUSION: ALA-PDT causes G₀-G₁ phase arrest of SW480 cell cycle in post-PDT earlier period; PDT-mediated induction of G₁/S checkpoint regulators Chk2 and P21WAF1/Cip1/Sdi1 results in the imposition of artificial checkpoint at G₁-S checkpoint thereby leading to an arrest of cells in G₀-G₁ phase of the cell cycle through inhibition in cyclinD1 in a time-dependent manner.

Key Words: N/A

0 引言

光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)抑制肿瘤细胞的作用机制仍不完全清楚. 已有研究表明PDT可通过阻滞细胞周期于G₀-G₁期来介导细胞凋亡[1]. 而近来研究表明G₁/S期关卡是影响细胞周期进程的关键限制点,他的转换决定着细胞是否进入S期继续增生还是停滞或死亡, 也是改进肿瘤治疗效果的理想干预点, 而G1/S关卡相关调控因子影响着这一进程[2]. 我们研究了ALA-PDT阻滞肿瘤细胞周期与G₁/S关卡调控因子chk2, p21 WAF1/Cip1/Sdi1, CyclinD1之间的可能联系.

1 材料和方法

1.1 材料

δ-氨基乙酰丙酸(δ-aminolevulinate acid, δ-ALA)购自Sigma公司, 在实验当天于避光条件下使用D-Hanks液配制过滤后密封, 避光保存于4 ℃备用. 人结肠腺癌SW480细胞株由第四军医大学实验动物中心细胞库提供; RPMI1640培养基购自Gibco公司; 新生小牛血清购自Hyclone公司; 小鼠抗人P21 WAF1/Cip1/Sdi1 mAb、小鼠抗人CyclinD1 mAb购自Santa Cruz公司; 小鼠抗人Chk2 mAb购自Neomarkers公司; 免疫组化EnvisionTM 试剂盒购自DAKO公司.

1.2 方法

SW480细胞常规在RPMI1640培养液(含100 mL/L灭活新生小牛血清, 青霉素100 ku/L, 链霉素50 g/L)中培养. 置于CO₂孵箱中, 恒温37 ℃, 50ml/L CO₂, 饱和湿度. 细胞培养密度0.1×10⁹-1×10⁹/L, 每3-4 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验. A实验组(1 mmoL/L ALA孵育6 h, 激光照射30 min); B正常对照组(不加ALA孵育, 不用激光照射); C光敏剂对照组(1 mmoL/L孵育6 h, 不用激光照射); D激光对照组(不加ALA孵育, 激光照射30 min).

1.2.1 ALA-PDT实验: 参照REN et al[3]及陈祖林 et al[23]的方法, 将SW480细胞按1×10⁸/L密度接种于培养板中(免疫组化实验需预置盖玻片), 待其贴壁后, 吸出含血清培养液后, D-Hanks液轻轻漂洗后弃去, 于暗室按预定时间加入含ALA(1mmol/L)的RMPI1640培养液(不含血清), 孵育6 h, 弃去含ALA之培养液, D-Hanks液轻洗后, 加入新鲜培养液, 实验组和激光组细胞使用半导体激光仪(西南师范大学激光所, 距光斑3 cm处输出功率15 mW, 能量密度 9 J/cm²)垂直照射培养孔, 于暗室连续照射30 min, 照射后细胞置培养箱中继续培养到实验设计各组时间, 0.25%胰蛋白酶液常规消化, D-Hanks液洗涤后收集备用.

1.2.2 SW480细胞周期蛋白表达: 消化收集各组细胞, 1 000 r/min离心5 min, PBS漂洗后吹打成单细胞悬液, 700 mL/L冷乙醇4 ℃下固定24 h后送检, 流式细胞仪(BD公司, FACStar-PLUS型)检测细胞周期. Envision法检测SW480细胞Chk2, cyclinD1, p21WAF1/Cip1/Sdi1蛋白的表达(按DAKO公司说明书, 稍加修改) PDT实验后6, 12, 24 h依次取出盖玻片, PBS轻漂洗后, 4 ℃冷丙酮液固定5min; 内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min, PBS漂洗后加入一抗(Chk2 1:100; cyclinD1 1:50; p21WAF1/Cip1/Sdi1 1:40), 湿盒内孵育, 4 ℃过夜; 加入Envision酶复合物, 37 ℃孵育30 min; PBS漂洗后DAB镜下显色, 水洗终止; 苏木素复染, 脱水, 透明, 封片. 结果判断: 光镜下观察, Chk2, CyclinD1, P21WAF1/Cip1/Sdi1蛋白阳性产物呈棕黄色, 以胞核为主, 少量胞质亦可见阳性颗粒. 采用美国Image-pro-plus图像处理系统(Media cybernetics公司)检测, 各实验分组中每个样本随机抽取5个区域进行阳性细胞平均吸光度值(Ax )值测定.

统计学处理 实验采用SPSS11.0软件处理数据结果, 采用均值t检验, 结果用mean±SD表示, 各组间相比采用配对t检验(显著水平a为0.05)

2 结果

2.1 ALA-PDT对SW480细胞周期的阻滞

PDT组细胞G₀/G₁期比例显著增加, 而S期和G₂/M期比例明显下降, 同时在PDT作用后早期(6 h)就可观察到此变化, 而在PDT作用后48 h阻滞作用最为明显(表1), 而在3个组中则未见此种变化(本文未显示数据).

表1 ALA-PDT作用后不同时相点细胞周期的变化(%).

分组	G0/G1期	S期	G2/M期
PDT前	30.5±5.5	36.9±1.4	30.7±5.1
PDT 6 h	48.0±0.3b	35.9±1.3b	16.1±1.0a
PDT 12 h	55.0±0.8b	33.3±1.9b	11.7±1.1b
PDT 24 h	61.0±2.6a	30.3±2.4	8.6±2.7a
PDT 48 h	72.6±5.8ad	21.9±2.9ac	5.6±2.9ad

^aP<0.05,

^bP<0.01, vs 上一组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 3个对照组.

2.2 ALA-PDT对SW480细胞P21WAF1/Cip1/Sdi1, CyclinD1及Chk2蛋白表达的影响

镜下观察可见, P21WAF1/Cip1/Sdi1, CyclinD1, Chk2蛋白表达均呈棕黄色颗粒, 主要分布于细胞核, 胞质可见有少量表达. 在PDT处理后, SW480细胞cyclinD1表达明显减弱, 阳性表达细胞比率降低, 阳性染色变淡, 而P21WAF1/Cip1/Sdi1和Chk2蛋白表达则在PDT处理后表达明显增强, 且均呈时间依赖性变化, 与对照组均有显著性差异 (见图1、表2).

图1 ALA-PDT作用SW480细胞前后的G₁/S关卡调控因子的表达(Chk2: A, B: CylinD1; C, D: P21WAF1; E, F: A, C, E为ALA-PDT作用前, B, D, F为ALA-PDT作用后6 h, PDT作用后Chk2, P21WAF1表达明显增强, CylinD1表达明显减弱.

表2 PDT作用后G₁/S关卡调控蛋白的表达 (A值mean±SD).

蛋白	分组	PDT前	PDT后6 h	PDT后12 h	PDT后24 h
CylinD1	PDT	0.317±0.017	0.256±0.020a	0.223±0.014b	0.216±0.014b
	光敏剂	0.317±0.017	0.298±0.016	0.283±0.060f	0.283±0.026g
	激光	0.317±0.017	0.282±0.015	0.269±0.011ac	0.263±0.012gh
	正常	0.317±0.017	0.310±0.020c	0.297±0.013f	0.280±0.016g
P21 WAF1	PDT	0.159±0.015	0.240±0.015b	0.258±0.016b	0.255±0.017f
	光敏剂	0.159±0.015	0.158±0.020c	0.162±0.017f	0.164±0.029h
	激光	0.159±0.015	0.152±0.021c	0.161±0.022f	0.172±0.022h
	正常	0.159±0.015	0.166±0.031c	0.158±0.018f	0.153±0.026h
Chk2	PDT	0.136±0.012	0.191±0.012b	0.195±0.018b	0.194±0.020a
	光敏剂	0.136±0.012	0.136±0.020d	0.145±0.014e	0.148±0.017
	激光	0.136±0.012	0.143±0.024c	0.168±0.012a	0.150±0.018g
	正常	0.136±0.012	0.163±0.034	0.141±0.034	0.142±0.046

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs PDT前;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs PDT6 h;

^eP<0.05,

^fP<0.01 vs PDT12 h;

^gP<0.05,

^hP<0.01 vs PDT24 h.

3 讨论

PDT作为一种全新的肿瘤治疗手段, 近年来备受重视. 但PDT抑制肿瘤细胞的作用机制, 仍不完全清楚, 一般认为单态氧以及其他可能的活性氧成分是产生PDT作用的必要条件. 大量研究表明, PDT可诱导肿瘤细胞凋亡, 也可引起肿瘤细胞坏死, 但目前仍无一种统一的机制来解释这种现象[4,24-26]. Ahmad et al[1]研究表明, PDT以时间依赖方式导致细胞G₀-G₁期阻滞和生长停滞, 存活率下降, 凋亡. 他们认为PDT诱导的P21WAF1/Cip1/Sdi1的增加抑制了G₁/S关卡转位, 从而通过抑制CyclinD1、细胞周期素依赖性激酶2 (cyclin dependent kinase 2, Cdk2)、Cdk6、CyclinE来使细胞阻滞在G₀-G₁期, 这种细胞周期阻滞是一种不可逆转的过程, 最终导致凋亡. Fisher et al[5]发现PDT可通过诱导肿瘤细胞视网膜神经胶质瘤蛋白(retinoblastoma protein, PRB)快速移位和去磷酸化, 从而诱导P53和P21WAF1/ Cip1/Sdi1(以下简称P21WAF1)的表达, 促使肿瘤细胞G₁/S期阻滞和凋亡.

在本研究中, ALA-PDT作用结肠癌细胞SW480后6 h, 即出现细胞生长减缓, 细胞存活率下降, 且表现为时间依赖性方式; 12 h后, 细胞开始出现明显的增生抑制, 活细胞总数有所下降, 而36 h后活细胞总数略有上升, 但细胞总数和存活率仍较对照组差异明显[6]. 流式细胞仪检测PDT后不同时相点结肠癌细胞周期变化, PDT后6-48 h细胞G0/G1指数由30.5±5.5%升至72.6±5.8%; S期指数则由36.9±1.4% 降到了21.9±2.9%; 而G2/M期指数由PDT后6 h的16.1±1.0%降到了5.6±2.9%. 这表明ALA-PDT可以通过阻滞SW480细胞于G₀/G₁期来抑制肿瘤细胞继续生长分裂, 抑制肿瘤细胞增生.

细胞周期关卡(cell cycle checkpoint)是指控制细胞增生周期中的限速位点, 他在DNA复制和有丝分裂前负责确定DNA合成的完整性, 监控DNA的复制, 在发生DNA损伤后修复和阻断细胞进入有丝分裂期, 精确调节细胞周期的进行, 以防止增生周期中发生错误[7]. 细胞周期关卡控制的失调可导致基因不稳定性, 增加癌症易感性[8]. 在细胞周期关卡调控中, G₁/S关卡的调控至关重要, 细胞在该点对DNA损伤、各类信号传导因子等复杂的细胞内外信号进行整合和传递, 决定细胞是否进行分裂、发生凋亡 , 或是进入G0期. G1/S关卡是细胞对DNA损伤的应激反应通路的重要枢钮, 是由感觉因子(sensor)、传导因子(transducer)和效应因子(effector)构成的信号传导通路[9]. 近来研究认为, 在G1/S反应通路的上游是ATM (ataxia-telangiectasia, mutated)和ATR(ataxia-telangiectasia and Rad3-related) 两个信号传导激酶, 属于磷脂酰肌醇激酶(PIK)相关家族; 传导因子主要是两个关卡激酶(check point kinase, Chk): 关卡激酶1(Chk1)和关卡激酶2(Chk2), 他们属于结构上无关但功能互补的丝氨酸/苏氨酸激酶家族, 也是ATM和ATR调控的靶点, 对DNA损伤做出反应. Chk下游是执行关卡反应的效应因子, 这主要包括Chk激酶的底物, 他们是与DNA修复、转录调节、细胞周期控制有关的相关蛋白, 如P21WAF1、P53、BRCA1、Cdc25A/C等[10-12,27-28].

Chk2 [13]可通过调控DNA修复和细胞存亡来调节细胞周期进程[14]. Chk2是保持细胞G1/S关卡完整性的关键信使, 他通过快速放大从DNA损伤到关卡效应因子的信号传导, 来延迟G₁/S期进程和激活DNA修复. G₁/S关卡调控机制通过ATM/ATR-Chk2-CDC25A关卡通路作用于下游效应因子来诱导快速的G₁/S细胞周期阻滞[15-16]. 做为对外界刺激的反应, 上游信号传导激酶ATM/ATR激活Chk2, Chk2活化后, 以关卡通路的下游效应物为靶点, 沿多个通路传导关卡信号, 最终引起细胞周期在G₁/S期阻滞, 激活DNA修复, 在细胞损伤严重的情况下, 诱导细胞凋亡坏死[17]. 目前已证实P21WAF1是Chk2的一个重要的下游关卡效应因子[15]. 研究表明Chk2是一个肿瘤抑制因子, Li-Fraumeni Syndrome横纹肌肉瘤家族均携带有突变的Chk2基因[18].

CyclinD1 是参与细胞周期G₁/S关卡转换的重要正性调节因子, 他在肿瘤细胞中的过度表达使细胞周期G1/S转换时间缩短, 进而促进细胞周期进程和细胞过度增生, 加速其分裂进程[2]. CyclinD1基因同时又是一种弱致癌基因, 可与多种癌基因协同促进细胞转化, 其临床意义与肿瘤类型密切相关[19]. 在正常细胞中CyclinD1受严格控制, 这是由于CDK抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)的抑制作用所致. P21WAF1是CKI家族最重要的成员之一, 是CyclinD1的主要抑制因子以及 G₁/S期关卡的重要调控因子, 现认为他可通过抑制Cyclin/CDK复合体, 阻滞DNA损伤后的细胞周期进程[20], 使细胞周期阻滞于G₁期以实现对G₁/S期的调节[21]. 他的G₁期关卡调节因子的关键性已被另外一项研究证实: 作为对外来应激的细胞反应, g射线照射可引起表达p21WAF1的细胞G₁期停滞, 但对缺乏p21 WAF1表达的细胞则不能发挥周期阻滞作用[22]. 肿瘤细胞的CKI-Cyclin-CDK调控机制在G1/S关卡存在不同程度的缺陷, 可表现为P21WAF1-CyclinD1-CDK调控机制失常[29-32]. 我们也发现SW480细胞在PDT处理前P21WAF1蛋白阳性表达较弱, CyclinD1则呈强表达, 而在PDT处理后二者呈相反的变化趋势.

PDT对肿瘤细胞的G₀-G₁期周期阻滞作用, 与G₁/S关卡调控因子的变化均表现出相同的时间依赖方式. PDT作用后Chk2和P21WAF1的蛋白表达呈逐渐增高趋势, 而CyclinD1的蛋白水平表达呈渐下降趋势, 表明PDT对SW480细胞的G₀-G₁期周期阻滞作用与对G₁/S关卡调控因子的调节密切相关. 综合实验结果可以初步推测: PDT处理后, PDT产生的光化学反应可能通过损伤肿瘤细胞DNA诱导了G₁关卡负向调控因子Chk2和P21WAF1的表达, 从而激活了ATM/ATR-Chk2-P21WAF1关卡通路, 肿瘤细胞在一定程度上恢复了G₁/S关卡调控机制, 活化的Chk2激活p21WAF1等下游效应因子, P21WAF1通过抑制CyclinD1与CDK的结合来诱导快速的G₁/S细胞周期阻滞, 使其发生坏死或凋亡.

备注

$[Footnotes]

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