胃癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-05-15; 12(5): 1030-1033
在线出版日期: 2004-05-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i5.1030
错配修复基因hMLH3在家族性胃癌中的突变
赵成海, 刘宏旭, 卜献民
赵成海, 中国医科大学病理生理教研室 辽宁省沈阳市 110001
刘宏旭, 中国医科大学附属第一医院胸外科 辽宁省沈阳市 110001
卜献民, 中国医科大学附属第二医院普外科 辽宁省沈阳市 110001
赵成海, 男, 1971-10-25生, 辽宁省庄河市人, 汉族. 1997年于中国医科大学硕士毕业, 讲师. 现主要从事肿瘤基础研究．
通讯作者: 刘宏旭, 110001, 辽宁省沈阳市和平区, 中国医科大学附属第一医院胸外科. hongxuliu@yahoo.com
电话: 024-23256666-6256
收稿日期: 2003-12-29
修回日期: 2004-01-03
接受日期: 2004-01-15
在线出版日期: 2004-05-15

目的: 检测错配修复基因hMLH3在家族性胃癌中的突变情况, 以探讨hMLH3在家族性胃癌中的作用.

方法: 采用聚合酶链反应(PCR)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)和直接测序法, 检查有遗传背景的16个胃癌家系(共84名成员)的错配修复基因hMLH3突变情况. 胃癌家系选择参考以下标准: (1)至少连续两代; (2)至少2例胃癌患者; (3)至少有1例患者为其他患者的一级亲属; (4)至少有1例患者50岁前被诊断出胃癌.

结果: 所有样品的外显子均成功进行PCR扩增, DHPLC分析和基因测序. 共在5个家系中发现5处错义突变(31.3%, 5/16), 4处在外显子1, 另外1处在外显子12. 家系6中hMLH3的突变与胃癌发生呈现出较强的相关性, 而另外几个家系中的突变情况与胃癌没有表现出明显的相关性. 在散发性胃癌及正常对照中未发现突变的存在.

结论: hMLH3基因在家族性胃癌发生中可能为一低风险基因, 他可能通过与其他基因互相叠加、共同起作用.

关键词: N/A
引文著录: 赵成海, 刘宏旭, 卜献民. 错配修复基因hMLH3在家族性胃癌中的突变. 世界华人消化杂志 2004; 12(5): 1030-1033
Mutation of mismatch repair gene hMLH3 in familial gastric cancer
Cheng-Hai Zhao, Hong-Xu Liu, Xian-Min Bu
Cheng-Hai Zhao, Department of Pathophysiology, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Hong-Xu Liu, Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Xian-Min Bu, Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Supported by: Swedish Institute Bilateral Scholarship and China Medical University Doctor Foundation.
Correspondence to: Dr Hong-Xu Liu, Department of Thoracic Surgery,First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. hongxuliu@yahoo.com
Received: December 29, 2003
Revised: January 3, 2004
Accepted: January 15, 2004
Published online: May 15, 2004

AIM: To detect the mutations of mismatch repair gene hMLH3 and to investigate its possible role in familial gastric cancer.

METHODS: A total of 84 members from 16 suggestive hereditary gastric cancer families were investigated with PCR, denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) and direct sequencing. The diagnostic criteria for familial gastric cancer are as follows: (1) at least two successive generations, (2) at least two patients with gastric cancer, (3) one of them should be first-degree relative of the other, and (4) at least one patient was diagnosed before 50 years old.

RESULTS: Five missence mutations were identified in five gastric cancer families, four mutations within exon 1 and one mutation within exon 12. Carcinogenesis was obviously associated with hMLH3 mutations in family 6, but not in other families. No mutations were found in sporadic gastric cancer and normal controls.

CONCLUSION: hMLH3 probably acts as a low risk gene in familial gastric cancer. The mutations of hMLH3 may work together with other genes and result in an elevated risk of gastric cancer in the family.

Key Words: N/A
0 引言

错配修复基因的缺陷与人类多种恶性肿瘤的发病关系密切[1-3], 其中hMLH1、hMSH2和hMSH6等基因的突变在遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)中的作用已得到广泛的证实[4-6]. 胃癌在我国常见[7-18], 也存在这些基因的变异或者失活以及其表达的改变[19-23]. hMLH3为一种新近被克隆和定性的错配修复基因, 可能是另一个与人类恶性肿瘤有关的错配修复备选基因. 目前已有学者在HNPCC患者中检出hMLH3突变[23-24], 且部分家系显示出该突变具有较强的致病性[24]. 我们对部分有遗传背景的胃癌家系进行研究, 以探讨hMLH3在家族性胃癌中的作用.

1 材料和方法
1.1 材料

有遗传背景的胃癌家系16个, 均来自于中国医科大学附属第一医院, 共有84名成员. 另散发性胃癌96例及正常对照96例. 胃癌家系选择参考以下标准: 至少两代; 至少2例胃癌患者; 至少有1例患者为另外1例的一级亲属和至少有1例患者50岁前被诊断出胃癌. PCR仪(UNO-II, Biometra); DNA片段分析仪(Wave 2100, Transgenomic)及WaveMaker4.1软件; DNA测序仪(Prism377, IBM). hMLH3基因12个外显子的17对引物, Ampli Taq Gold酶(5MU/L, Biosystems); DHPLC分析缓冲液: 三乙基醋氨酸及已腈(Bie &Bernsten A-S); DNA测序试剂盒( Biosystems); PCR纯化试剂盒(Qiagen 公司).

1.2 方法

按常规方法提取血液和肿瘤组织DNA. 将hMLH3基因第1外显子划分为7个重叠的片段, 而将片段过短且相距很近的外显子9和10划为1个片段, 因此共设计17对引物. 聚合酶链反应体系共50 mL, 含有100 ng基因组DNA, 1×PCR缓冲液, 1.5 mmol/L的Mg2+, 100 mmoL/L的各种dNTP, 0.2 mmoL/L 的各种引物和Ampli Taq Gold聚合酶1.25 U. PCR片段的长度、引物序列、相应的退火温度及PCR的反应程序参考文献[24]. DHPLC分析在装有DNA层析柱的DNA片段分析仪中自动进行. 具体操作程序参考文献[24].层析柱中DNA双链分离后, 可被紫外线吸收仪在波长为254 nm处检测到, 表现为特征性的洗脱峰. 同源双链(纯合的野生型)DNA表现为单一窄峰, 而突变型和野生型DNA组成的异源杂合双链则表现为提前出现一个或多个的额外洗脱峰. 在PCR产物测序中将经DHPLC检测有异常峰型的DNA样品作为检测重点, 进行测序. 步骤: (1)重新进行PCR扩增; (2)PCR产物纯化; (3)DNA测序试剂盒进行测序反应; (4)DNA测序仪上电泳, 测出碱基序列.

2 结果

在全部样品中所有外显子均成功进行PCR扩增(图1), DHPLC分析(图2)和基因测序(图3). 共在5个胃癌家系中发现5 处错义突变(31.3%, 5/16). 尽管未发现无义突变和移码突变, 但在散发性胃癌及正常对照中均未检出上述错义突变的存在(表1).

表1 hMLH3在家族性胃癌中突变情况.
外显子核苷酸改变氨基酸改变家系胃癌家系中的频率散发胃癌中的频率对照中的频率
11A1234GLys412Glu22.4% (2/84)0% (0/96)0% (0/96)
1A2173CAsn725His64.8% (4/84)0% (0/96)0% (0/96)
1G2221TVal741Phe134.8% (4/84)0% (0/96)0% (0/96)
1T2896CSer966Pro86.0% (5/84)0% (0/96)0% (0/96)
12G4351AGlu1451Lys163.6% (3/84)0% (0/96)0% (0/96)
1根据cDNA的起始密码子计数, 基因库号码AF195657.
图1
图1 hMLH3各片段PCR产物脂糖凝胶电泳. M: 分子质量标记物.
图2
图2 DHPLC图像. 正常对照(纯合性)表现为单一的洗脱峰; 而发生突变形成异源杂合双链的DNA表现提前出现的额外洗脱峰.
图3
图3 测序结果示外显子12中的杂合子的错义突变, G4351A, 导致Glu1451Lys.

错义突变A1234G见于家系2中. 该家系有1例65岁胃癌患者及其1例32岁健康子女被检出这种突变. 但其患胃癌的弟弟及健康的姐姐没有检出(图4A). 错义突变A2173C见于家系6中. 该家系共有祖孙三代3例胃癌患者及1例健康亲属被检出, 显示出这种突变与该家系胃癌发生具有较强的相关性(图4B). 错义突变G2221T见于家系13中. 该家系患胃癌的父亲及其2例患大肠癌的儿子被检出.但其另1例患胃癌的儿子却没有检出. 该家系还有1例健康亲属被检出(图4C). 错义突变T2896C见于家系8中. 该家系共有5例成员被检出, 包括2例胃癌患者(父女)及1例大肠癌患者. 同时他们的2例健康亲属也被检出. 但该家系另1例女性胃癌患者未被检出(图4D). 错义突变G4351A见于家系16中. 该家系由父亲、母亲及其3例子女构成. 患胃癌的父亲没有检出. 但患大肠癌的母亲和1例患胃癌的儿子及另1例健康的儿子被检出(图4E).

图4
图4 有hMLH3基因突变的家系. GC: 胃癌; CRC: 大肠癌; +: 变异体携带者; -: 非变异体的携带者. A: 家系2 A1234G; B: 家系6 A2173C; C: 家系13 G2221T; D: 家系8 T2896C; E: 家系16 G4351A.
3 讨论

在我国的各种恶性肿瘤中, 胃癌一直具有较高的发病率和死亡率. 一些地区的胃癌患者亦呈现出明显的家族性, 显示出遗传因素在胃癌的发病中具有重要作用. 目前一般认为在消化道上皮恶性肿瘤中起作用的基因主要有三类: 癌基因, 抑癌基因及错配修复基因. 后者编码的错配修复系统可检查DNA双螺旋上错配的碱基对, 将其切除并重新合成正确的碱基对. 错配修复基因的突变可导致DNA复制后的修复缺陷, 产生基因组的不稳定性, 引起关键作用的基因突变频率显著增加, 特别是那些与癌变相关的原癌基因、抑癌基因或其他基因的突变, 导致肿瘤的发生. Fang et al[19]在68例胃癌患者中发现2例hMSH6移码突变. Menoyo et al[20]对23例MSI阳性的散发性胃癌移码突变研究中发现, 分别有56%和43%的患者具有hMSH3和hMSH6的移码突变. 但没有检出hMLH3移码突变, 尽管他们发现1例hMLH3腺嘌呤缺失. 然而更多的研究显示, hMLH1启动子甲基化导致其失活及表达改变或消失[21-22], 在一些胃癌的发病中可能起到更大的作用.

hMLH3是2000年克隆并定性的一种错配修复基因, 定位于14q24.3, 编码全区长4.3 kb, 由12个外显子组成. 由于其存在与hMLH 1相互作用的区域[25], 且与酵母的MLH3极为相似[25], 因此被预测可能是另一个与人类恶性肿瘤有关的错配修复备选基因. Wu et al[23]对288个疑似有HNPCC的索引患者的筛查中发现12个病例中存在10个不同的hMLH3生殖系突变, 1例移码突变和9例错义突变. Liu et al[24]在对70个HNPCC家系的研究中共鉴定出一个移码突变和9个错义突变. hMLH3与胃癌的关系除了前文所提的Anna Menoyo外, 再未见其他报道. 然而Anna Menoyo et al的研究对象是散发性胃癌, 他们也只观察了移码突变的情况, 其他的突变情况并没有涉及. 本文的研究尽管亦没有发现移码突变, 但发现了5处错义突变. 尤其是在家系6中由于祖孙三代3例胃癌患者均检出A2173C突变, 显示出该突变在这个胃癌家系中可能具有较强的致病性. 在其他的家系中, 尽管突变与胃癌没有显示出较强的相关性, 但在散发性胃癌及正常对照中均未检出同样的突变, 从而显示这些家系中存在的突变可能也具有一定的致病性.目前推断hMLH3基因可能作为一个低风险的等位基因, 他可能通过与其他基因互相叠加、共同起作用, 在一些家系中提高了患HNPCC及胃癌等恶性肿瘤的风险. 但其确切的作用, 尚需进行蛋白功能方面的深入研究.

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