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世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 948-950
在线出版日期: 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.948
核因子B的信号转导机制及研究策略
巨立中, 成军, 钟彦伟
巨立中, 成军, 钟彦伟, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目No.98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 10039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 巨立中, 成军, 钟彦伟. 核因子B的信号转导机制及研究策略. 世界华人消化杂志 2004; 12(4): 948-950
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

核因子B (nuclear factor of B, NF-B)是一种广泛存在的转录因子, 几乎每个真核细胞中都存在NF-B, 不同的刺激信号激活该转录因子后, 参与相应的基因表达的调控, 如细胞的生长、分化、凋亡、炎症反应、肿瘤发生等[1-2]. 由于其广泛的生物学活性, 对NF-B的研究为阐明某些疾病的发病机制及治疗具有重要的意义.

1 NF-B的结构及信号转导机制

1986年, Sen et al[3]首次发现成熟浆细胞中存在与免疫球蛋白轻链基因的增强子序列特异性结合, 并促进链基因转录的核蛋白因子. 随后的研究发现, NF-B是一种普遍存在的转录因子, 已发现有150多种物质可以激活NF-B, 受NF-B调控的基因多达150种[4]. 最初研究发现NF-B是由p50和p65两个亚单位组成的异二聚体, 后来发现存在有NF-B家族, 由于NF-B与Rel家族有较强的同源性, 所以又把NF-B与Rel合称为Rel/NF-B家族, 在哺乳类动物中已发现Rel/NF-B家族的5个成员: p65(RelA)、RelB、c-Rel、p50(NF-B1)、p52(NF-B2). 在大多数细胞中, p50和p65是NF-B活性形式的主要成分, 所以通常所说的NF-B或Rel/NF-B即为p50/p65异源二聚体. NF-B特异的结合位点是B, 其DNA序列为5'-GGGRNYYYCC-3'(R为任一嘌呤, Y为任一嘧啶, N为任一核苷酸), 该序列也称为B元件. NF-B家族成员在N-端有一个约300个氨基酸残基(aa)的高度保守的Rel同源区, 负责NF-B因子的二聚化、核定向易位、与DNA及IB结合. 根据C-端的结构和功能不同, 将NF-B因子的组成肽链分为p50和Rel组, p50组包括p50、p52, 而Rel组包括p65、RelB、c-Rel. p50组成员的主要功能是结合DNA, 不具有转录激活功能. Rel组成员具有转录激活作用. p50组成员和Rel组成员间形成的异源二聚体为转录激活复合物, 而p50组间形成的同源二聚体为转录抑制复合物. 通常NF-B与IB (inhibitory protein of NF-B)结合. NF-B的激活受其胞质抑制蛋白IB的调控, IBs与NF-B结合, 掩盖他的核定位信号, 从而使NF-B滞留在细胞质内, 处于无活性状态. IB也是一种大的抑制分子家族, 包括IB、IB、IBε、IB、Bcl-3和Caltus(果蝇中)等成员, 它们的共同特点是在C-端有锚蛋白(Ank)重复序列, 除了Bclε外, 其他IB成员有一个与降解有关的PEST区. Bclε是惟一位于核内并促进NF-B转录, 而非抑制NF-B核易位的IB家族成员[5-8]. 另外, Cohen et al[9]在研究促炎症细胞因子激活NF-B的信号转导中, 分离到一个较大的白介素-1(IL-1)诱导的IKK复合物, IKK是由IKK、IKK和IKK三个亚单位组成的三聚体, IKK和IKK共同有一个与降解有关的kD区和一个亮氨酸拉链(LZ), IKK、IKK和IKK三者功能不同, 且不可相互替代, IKK和IKK为酶解功能单位, IKK为调节单位, 负责对IKK和IKK的活性进行调节. NF-B信号转导通路十分复杂, 多数认为是: 各种信号经由不同的方式激活IKK, IKK进一步将IB磷酸化, 例如IBa的磷酸化部位分别在Ser32和Ser36, 而IB的磷酸化部位在Sre19和Ser23. 接下来在泛素连接酶的作用下, IB上的某些Lys发生泛素化, 导致IB被26S的蛋白酶体水解, 于是受其抑制的NF-B得以释放, 发生核易位, 进入细胞核与相应的B位点结合, 启动特异的靶基因转录[10].

2 NF-B的研究策略

由于NF-B有多种功能, 其信号转导途径亦十分复杂, 对它的研究方法多种多样, 目前研究的主要目的在于阐明: 什么因子可以激活NF-B; 什么因子可以抑制NF-B的激活？这些因子是通过何种径作用的? NF-B被激活后用什么手段进行证实? 下文介绍几种常用的关于NF-B的研究策略, 根据实验目的, 可以单独应用, 但更多的是将几种方法结合使用.

2.1 转基因小鼠模型

Carlsen et al[11]于2000年建立了一种转基因小鼠动物模型, 用来在体内动态观察NF-B的活性. 模型的构建方法为: (1)将Ig轻链启动子基因(至少含3个NF-B的结合位点)与荧光虫的荧光素编码基因相连构成3x-B-luc目的基因, 将该基因与质粒相连, 构成表达载体, 用HindⅢ和BglⅠ使质粒载体线性化; (2)♀小鼠(C57BL/6J×CBA/J)与♂小鼠交配, 取出受精卵, 用微注射法将线性化的质粒注入受精卵内, 将该受精卵植入假孕小鼠子宫内, 3x-B-luc基因阳性的子代小鼠可用来作为模型; (3)由于该转基因小鼠携带有NF-B控制的萤光素酶编码基因, 能使萤光素发光, 因此可根据不同的需要将完整的小鼠或部分器官与一特殊的显像系统相连, 先给小鼠注射D-萤光素, 再根据需要注射不同的NF-B激活物如肿瘤坏死因子(TNF)等, 用显像系统观察不同部位的光强度, 根据光强度判断NF-B的活性. 他们的研究结果表明, 在无外界刺激的情况下, 小鼠的颈部淋巴结、胸腺、腹部集合淋巴结有强的发光, 用TNF, IL-1或脂多糖(LPS)刺激小鼠后, 光强度明显增加且呈组织特异性, 即皮肤、肺、脾、小肠壁、腹腔集合淋巴结最强, 肝、肾、心、骨胳肌次之, 脂肪组织最弱. 进一步用紫外线照射皮肤或建立类风湿关节炎模型, 相应的皮肤区及受累关节光强度明显增加. 该模型用途广, 特异性好, 不仅用来阐明某些疾病的发病机制, 也可用来筛选抑制NF-B活性的药物, 如给小鼠注射TNF之前注射地塞米松, 则相应部位的光强度未增加, 表明地塞米松能抑制TNF激活NF-B的作用[12-13].

2.2 抗体定位及酶学检测

如前所述, 刺激因子激活NF-B, 其易位于核内, 与靶基因结合发挥作用. 检测NF-B是否定位于核内, 可判断NF-B是否被激活, 常用抗p65的单克隆抗体作为一抗, 用异硫氰酸荧光素标记的兔抗鼠抗体为二抗, 将细胞与抗体孵育后用免疫荧光分析法确定p65的位置, 将这一方法称为抗体定位法. Purcell et al[14] 用p65单克隆抗体免疫荧光分析法检测到乙型肝炎病毒X蛋白(pX)能通过不依赖IKK的途径激活NF-B. 该法简便易行, 但可靠性略差, 因此常将该法与酶学检测结合使用[15-16]. 酶学检测的基本原理为: 将Ig链的基因片段(含NF-B的结合位点)与虫荧光素酶编码基因(报告基因)相连, 构建质粒表达载体, 将该载体转染细胞, 用刺激因子如TNF激活NF-B, 报告基因表达荧光素酶, 通过对该酶的检测, 可确定某因子是否激活NF-B及NF-B是否发挥转录调节作用. 将抗体定位与酶学检测结合使用, 不仅能确定NF-B是否易位入核内, 而且能得知NF-B是否发挥转录调节作用.

2.3 DNA迁移率变动试验

DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay, EMSA), 又叫凝胶阻滞(gel retardation)试验, 是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术.基本原理为[17] : 在凝胶电泳中, 由于电场的作用, 小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快, 因此, 可标记短的双链DNA片段, 将其与蛋白质混合, 对混合物进行凝胶电泳, 若目的DNA与特异性蛋白质结合, 其向阳极移动的速度受到阻滞, 对凝胶进行放射性自显影, 就可证实特异性DNA与相应蛋白结合. 在进行NF-B研究中, 标记Ig轻链DNA, 与特异性刺激因子刺激的细胞核提取物作用, 然后进行DNA迁移率变动试验, 若该刺激因子能激活NF-B, 后者易位入细胞核内, 则核提取物中出现NF-B, 标记的DNA与NF-B结合, 进行放射性自显影可发现二者结合及结合的位点, 反之亦然. 该实验已广泛用于NF-B的研究中[18-21], 其不仅能证实某些疾病的发病与NF-B有关, 而且用于阻断NF-B活性的药物的筛选. Herfarth et al[22]证实, 在葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium)激活NF-B后所致小鼠的结肠炎发病中, NF-B的激活可被胶毒霉素(gliotoxin)阻断, 因而认为胶毒霉素是有希望的治疗结肠炎的药物.

2.4 显负性突变体的应用

显负性突变是基因的构成突变, 这种突变体基因表达有缺陷的产物, 即表达产物可与野生型基因表达产物结合, 但结合后使野生型基因表达产物失去激活作用[23]. 显负性突变体在NF-B信号转导研究中应用十分广泛, 显负性突变体主要用来做对照, 根据实验目的, 可构建多种显负性突变体[23-27]. 如为阐明某刺激因子是否通过IKK途径激活NF-B, 可构建该因子的显负性突变体作对照, 将突变型因子及野生型因子分别与IKK作用, 以观察刺激因子能否通过IKK途径激活NF-B. Nemoto et al[28]为了研究有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1, MEKK1)对IKK复合体的激活作用, 构建了MEKK1的显负性突变体, 经实验证实, 野生型MEKK1对IKK有激活作用, 而显负性突变体MEKK1不仅不能激活IKK, 而且有阻碍TNF激活IKK的作用.

编辑: N/A

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