乙、丙型肝炎病毒基因联合诊断芯片的研制及应用

摘要

目的: 制备一款肝炎病毒检测芯片, 能同时实现对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HBV YMDD变异株及HCV基因型的检测, 并与其他检测方法进行比较, 以探讨基因芯片技术临床应用的可行性.

方法: 根据HBV、HCV的序列设计出探针, 采用点样法制备芯片.收集HBV DNA阳性和HCV RNA阳性血清各20份, YMDD变异株阳性血清20份, HBV DNA阴性和HCV RNA阴性血清各10份, 用基因诊断芯片检测, 并与荧光定量法、错配PCR及测序法比较.

结果: HBV DNA阳性标本和HCV RNA阳性标本用芯片检测均为阳性; 芯片法检测HBV YMDD变异株和错配PCR法的符合率为75%, 和测序法的符合率为95%; 芯片法检测HCV基因型和测序法的符合率为75%.

结论: 基因诊断芯片的敏感性和特异性较高, 且能检测出不同病毒株的共生状态, 但在检测HCV基因型方面存在一定的假阴性和假阳性.

关键词: N/A

Development and application of a mixed microarray in detection of genes of HBV and HCV

Wei Chen, Gang Li, Hui-Hui Ma, Zheng-Hao Tang, Cheng-Hui Huang, Xiao-Yan Han

Wei Chen, Xiao-Yan Han, Medical Research Center, Third Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Gang Li, Hui-Hui Ma, Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Zheng-Hao Tang, Department of Infectious Diseases, Shanghai Sixth People's Hospital, Shanghai 200233, China

Cheng-Hui Huang, Shenzhen Bao'an Blood Center, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China

Supported by: the Key Project of the Department of Science and Technology of Guangdong Province, No. 2km05302s.

Correspondence to: Gang Li, Medical Research Center, Third Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China. ligangzh@public.guang.gd.cn

Received: October 9, 2003
Revised: November 1, 2003
Accepted: February 1, 2004
Published online: April 15, 2004

Abstract

AIM: To develop a DNA microarray to detect hepatitis virus B (HBV) DNA, hepatitis virus C (HCV) RNA, HBV YMDD mutant and HCV genotype simultaneously. At the same time, the chip was compared with other techniques to evaluate its prospect in clinical application.

METHODS: A set of probes was designed to detect HBV DNA, HCV RNA, HBV YMDD mutant and HCV genotype. The probes were synthesized by DNA synthesizer. The microarray was prepared by spotting the probes onto the specially treated glass sliders. Serum samples were collected from inpatients and outpatients at the Department of Infectious Diseases, the Third Affiliated Hospital of Zhongshan University. Among the samples, 20 were comfirmed HBV DNA positive by fluorescent quantitation PCR, 20 were HCV RNA positive, 20 were comfirmed YMDD mutant by mismatched PCR, 10 were HBV DNA and HCV RNA negative. HBV DNA and HCV RNA were extracted from the serum, then amplified by asymmetric PCR or RT-PCR in the presence of sense fluorescein labeled primers. The products of HBV YMDD and HCV NS-5 were purified and sequenced. Following the hybridization of amplified products on the microarrays, detection was carried out by the fluorescence scanner. The detection results were obtained by analyzing the intensity and ratio of the fluorescence signals using image analysis software.

RESULTS: For the HBV DNA positive samples and HCV RNA positive samples, an intensive signal was observed at the point of corresponding probes on the microarrays. In detection of YMDD mutant, the coincident rate of the microarray and the mismatched PCR was 75%, the coincident rate of microarray and sequencing was 95%. In detection of HCV genotype, the coincident rate of microarray and sequencing was 75%.

CONCLUSION: The technology of microarray appears to be versatile, with a great sensitivity and specifity in detection of HBV and HCV. Furthermore, it can find co-infection of different virus strains. But it has some false negative rate and false positive rate in HCV genotyping.

Key Words: N/A

0 引言

基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针, 有规律地排列固定于支持物上, 然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交, 再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描, 并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出分析比较, 从而迅速得出所要的信息[1]. 通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值, 如基因表达谱分析、突变检测、单碱基多态性分析、杂交测序(SBH)、药物筛选及病原体检测[2-14]等.我们将基因芯片技术应用于常见传染病-病毒性肝炎的诊断, 并与其他检测方法比较, 探讨基因芯片在临床诊断方面的价值.

1 材料和方法

1.1 材料

血清标本来自中山大学附属第三医院传染病科2002/2003年住院和门诊患者, 其中HBV DNA阳性血清20份, HCV RNA阳性血清20份, YMDD变异株阳性血清20份及HBV DNA, HCV RNA阴性血清各10份.

1.2 方法

从GeneBank下载HBV, HCV的相关序列资料, 设计出一套分别用于检测HBV DNA, HCV RNA, HBV YMDD变异株及HCV基因型的探针. 采用点样法将合成好的寡核苷酸探针用点样仪按一定的矩阵点在表面经过醛基化处理的玻片上, 同时点上用于系统监控的阴性参照、阳性参照和空白对照(表1). 设计引物 根据HBV、HCV的基因组序列, 设计6对引物. 有关的HCV靶基因设计了内、外引物各一对以进行巢式PCR. 其中引物PBS, P4, S2和YS的5'端用荧光素Cy3标记. 取血清100 L, 加入0.5 mL无菌离心管中, 98 ℃ 15 min, 12 000 r/min, 离心5 min, 取上清为模板; 将引物PBA稀释10倍, 使PBS与PBA浓度之比为10: 1, 进行不对称PCR. 循环参数为94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 45个循环, 72 ℃ 10 min; 将引物YA稀释10倍, 使YS与YA浓度之比为10: 1, 进行不对称PCR. 循环参数为94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 45个循环, 72 ℃ 10 min; HCV RNA阳性血清100 L加入1 mL TRIZOL溶液, 充分混合, 室温放置15 min, 加入0.2 mL氯仿, 振荡摇匀, 室温放置10 min, 4 ℃ 12 000 rpm离心10 min, 吸取上层水相置于另一无菌离心管中, 加入等体积异丙醇, 室温沉淀10 min, 4 ℃ 12 000 r/m离心10 min, 弃上清, 75%乙醇洗两遍, 沉淀的RNA于室温下自然干燥, 用10 L DEPC水重悬沉淀RNA, 置于冰浴立即用于合成cDNA; 采用逆转录试剂盒(MBI), 按说明书操作; 第1次扩增用外引物P1, P3(表2)进行对称PCR, 循环参数为94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 40 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环, 72 ℃ 10 min. 取第1次扩增产物5 L, 稀释10倍后取5 L作为模板, 加入内引物, 并将引物P2稀释10倍, 进行不对称PCR, 反应体系和循环参数同第1次扩增; 第1次扩增用外引物S1, A2(表2)进行对称PCR, 循环参数为94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环, 72 ℃ 10 min. 取第1次扩增产物5 L, 稀释10倍后取5 L作为模板, 加入内引物, 并将引物A1稀释10倍, 进行不对称PCR, 反应体系和循环参数同第1次扩增. 取四种PCR产物各2 L, 与24 L杂交液混匀, 取10 L杂交混合物加于芯片反应区中, 于45 ℃水浴中杂交1 h. 杂交反应结束后将芯片依次用洗液A, B, C各清洗1 min, 室温晾干.扫描仪为GenePix4000B; 激光强度和PMT设置为650和33; 激发波长为532 nm; 根据配套软件分析结果.HBV P 区包含有YMDD区域的片段及HCV NS-5区片段的序列测定和分析.取PCR产物50 L电泳, 切取目的条带, 凝胶回收纯化DNA按QIA quick Gel Extraction kit试剂盒说明书进行. PCR产物纯化后, 采用双脱氧链终止法, 在ABI377全自动测序仪上进行双向测序, 测序工作由上海博亚公司和上海生工生物工程服务公司完成.

表1 用于不同检测目的的探针序列.

No	Sequence(5'-3')		Tm	GC%	Target
1	ATA AAG CCT CTC GGT GA		47.4	47	1 a
2	CAC CGG CGA TAA CC		46.2	64	1 b
3	GCA CCG GCG GTA GC	Length	46.8	79	1 b
4	GAT GTA GCA GGT GAG AGT G	17	47	53	1 c
5	GAG AGT GTT ACC GCA GC	14	47.9	59	1 c
6	CAG CGA GTG TAT GGC A	16	47.8	56	2 a
7	TGT AAC CGC AGG ATT G	16	46.8	50	2 b
8	TGC CCT TTG CTG TTT	1 5	46.2	47	2 c
9	CGC AGT AAA GCC GC	14	47.6	64	3 a
10	GTC TTT GAG ACC CGC G	16	48.1	63.5	3 b
11	GGG CAG TAA TAA CCT T	16	47.7	43.75	4 a
12	GCG TTG GGT GAG TGA C	16	48.1	64	5年
13	CAG TCC TTG ATG TTG GC	17	48.1	53	6 a
14	CGA TAG CCG CAG TTT TG	17	47.6	53	1 b
15	CGA TAG CCG CAG TTC TG	17	48.3	62.5	1 b
16	AGG TGA AGC GAA GTG C	16	47.9	56	HBV
17	GTT CCG CAG ACC ACT AT	17	47.1	53	HCV
18	AT CAT CCA CAT AAC TGA	17	43.2	35	YVDD
19	ACA TCA TCA ATA TAA CT	17	38.3	24	YIDD
20	CAT CAT CCA TAT AAC TGA	18	45.5	33	YMDD

表2 HBV, HCV基因相关引物.

Name	Polarity	Position	Sequence(5'-3')
PBS	+	1 526	CGCACCTCTCTTTACGC
PBA	-	1 795	ATTTATGCCTACAGCCTCC
P1	-	320	ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACC
P2	-	310	CACTCTCGAGCACCCTATCAGGCAGT
P3	+	33	CTGTGAGGA ACTACTGTCTT
P4	+	60	TTCACGCAGAAAGCGTCTAG
S1	+	8 199	GTSAAYRCCTGG AAA TCAAAGAA
S2	+	8 229	ATGGGSTTYKCRTATGACACC
A1	-	8 557	CAGATAACGACAAGGTCGTCTC
A2	-	8 624	GTACCT AGTCATAGCCTCCGTG
YS	+	673	AGT GCM ATTTGTTCAGTG
YA	-	1 105	CCTTGTAAGTTGGCGA

Y = C, T; K = T, G; R = A, G; S = C, G; M = A, C.

2 结果

2.1 基因芯片检测HBV DNA和HCV RNA

用HBV DNA荧光定量检测证实为HBV DNA(＋)的血清标本20份和HCV RNA荧光定量检测证实为HCV RNA(＋)的血清标本20份, 与芯片杂交后, 在相应探针位置均出现很强的杂交信号, 阴性血清无杂交信号(表3, 4).

表3 基因芯片和荧光定量检测HBV DNA的比较.

芯片法	定量法		合计
	阳性	阴性
阳性	20	0	20
阴性	0	10	10
合计	20	10	30

表4 基因芯片和荧光定量检测HCV RNA的比较.

芯片法	定量法		合计
	阳性	阴性
阳性	20	0	20
阴性	0	10	10
合计	20	10	30

2.2 基因芯片检测HBV YMDD变异株

用错配PCR法检测为YMDD变异的血清标本20份, 扩增产物回收纯化后进行DNA序列测定, 结果为YMDD野生株4例, YVDD变异株12例, YIDD变异株3例, 还有1例的蛋氨酸(M)三联体密码的第3个碱基由G变为A. 芯片检测结果为YMDD野生株3例, YVDD变异株10例, YIDD变异株2例, YVDD+YIDD3例, YMDD+YVDD+YVDD1例, 有1例未能检出(表5).

表5 芯片法和测序法检测HBV YMDD变异株的结果比较.

芯片法	测序法						合计
	YMDD	YVDD	YIDD	V+I	M+V+I	其他
YMDD	3	0	0	0	0	0	3
YVDD	0	10	0	0	0	0	10
YIDD	0	0	2	0	0	0	2
V+I	0	2	1	0	0	0	3
M+V+I	1	0	0	0	0	0	1
未检出	0	0	0	0	0	1	1
合计	4	12	3	0	0	1	20

2.3 基因芯片检测HCV基因型

HCV NS-5区扩增产物20份回收纯化后进行DNA序列测定, 4份测序不成功.16份测序结果用GeneBank的Blast软件进行在线比对, 并用DNAStar和GeneBank中的HCV标准株序列进行同源性分析, 结果表明16份测序样品均为HCV 1b型; 芯片检测结果为HCV 1b型11例, 1c型2例, 1b型＋3b型1例, 有2例用芯片未能分型(表6).

表6 芯片法和测序法检测HCV基因型的结果比较.

芯片法	测序法
	1 b	1 b＋3 b	1 c	未检出	合计
1 b	11	0	0	0	11
1 b＋3 b	1	0	0	0	1
1 c	2	0	0	0	2
未检出	2	0	0	0	2
合计	16	0	0	0	16

3 讨论

在我国, 病毒性肝炎的发病率很高[15-17], 其中以引起慢性肝炎的乙型、丙型肝炎病毒对患者危害最大[18-24], 是发展为肝硬化, 肝功能衰竭和原发性肝癌的主要危险因素之一[25-27], 临床上很多情况下对HBV、HCV的基因都要进行检测. 此外, 随着HBV治疗药物拉米夫定的广泛使用, HBV耐药现象的出现已成为临床应用的一个棘手问题[28-32], 有效检测HBV耐药相关DNA突变成为指导临床用药, 提高治疗效率, 降低患者负担的重要手段. 目前, 最常用的HBV耐药基因诊断方法是DNA测序法. 该方法准确但成本较高, 临床应用有一定局限性; 另一缺点是对感染病毒中优势株的检测效果较好, 但较难发现非优势株, 不能检测多种病毒株并存的情况. 由于HCV RNA变异大, 除存在不同型外, 还有很多亚型, 而HCV的基因型在分子流行病学、干扰素疗效评估及疫苗研制等方面具有重要意义[33-38]. 目前国内尚无普遍推广使用的HCV分型标准试剂盒, 应用较多的是LiPA方法[39], 此法成本较高, 操作较复杂. 基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上, 所以可以一次性对样品中大量序列进行检测和分析, 基因芯片在病毒性肝炎诊断上的价值在于, 有可能对多种病毒以及病毒的耐药性、变异型等情况, 通过一张芯片同时诊断出来.

实验结果表明, 芯片对HBV DNA和HCV RNA的检出率达到100%, 这和本实验所用的标本有一定关系.为了成功地获得目的片段, 我们选择了荧光定量检测报告病毒拷贝数较高的血清标本. 对于HCV RNA阳性的血清标本, 我们采用巢式PCR扩增.HBV DNA阳性标本20例和HCV RNA阳性标本20例芯片检测皆为阳性, 扩增产物稀释16倍后, 仍可检测到很强的荧光信号, 阴性血清芯片检测全部阴性. 说明HBV DNA、HCV RNA检测探针设计合理, 芯片质量控制较好, 无假阳性出现, 芯片具有较好的敏感性和特异性. 基因芯片检测HBV YMDD变异株与测序法比较, 二者完全一致的15例(15/20), 部分一致的有4例(4/20), 两种方法的符合率为95%, 此外, 有些测序报告为单一病毒株的样品, 和芯片杂交后, 在不同的探针位置都有阳性荧光信号, 且信号强度有差别, 考虑为不同病毒株共存, 信号强的探针所对应的病毒株即为优势株, 实验中还发现, 芯片检测HBV YMDD变异株时有1例未检出, 假阴性率为5%, 假阴性的出现是因为在探针对应的序列附近有碱基发生突变, 由此可见, 基因芯片检测HBV YMDD变异株的敏感性和特异性均较高, 还能检测出野生株和变异株共存情况, 这有利于判断病情变化和指导临床用药. 用芯片检测HCV基因型时假阴性率和假阳性率各为12.5%, 通过比较测序结果和探针序列, 发现假阴性的出现是由于2例标本的核酸序列与探针在相应区域有1-2个碱基不同, 而且这些有差异的碱基接近探针的中心位置, 致使杂交时不能结合; 假阳性的出现则是因为有2例标本的核酸序列与探针序列很接近, 碱基差异位于探针5'端, 二者发生非特异性结合.

基因芯片技术是在PCR的基础上用核酸杂交加以确认, 有较高的灵敏度和特异性, 可以直接检测病原体, 尤其针对用常规检测方法灵敏度低、费时、难以判断预后、或不能对具有治疗意义的亚群进行检测的病原体, 则更有价值.但在实际操作中, 直接采用核酸杂交进行检测, 杂交信号难以检测, 导致敏感性低, 所以在目前, 样品扩增, 如通过PCR来提高敏感性仍是必不可少的措施, 但亦导致实验步骤的复杂化和扩增环节带来的假阳性和假阴性. 因此, 从多个方面进行优化, 包括标记方式的改进, 提高杂交信号检测仪器的灵敏度, 杂交温度的控制等都是基因芯片能否用于临床检测的关键[40-42].

备注

编辑: N/A

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