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世界华人消化杂志. 2004-03-15; 12(3): 751-753
在线出版日期: 2004-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i3.751
胃癌MGMT基因启动子CpG岛甲基化与蛋白表达缺失
齐健, 朱尤庆, 杨冬, 张友才, 张蔚英, 刘军, 魏芸
齐健, 朱尤庆, 杨冬, 张友才, 武汉大学中南医院消化内科湖北省武汉市 430071
张蔚英, 刘军, 魏芸, 武汉大学医学院病毒所 湖北省武汉市 430071
基金项目: 2002年湖北省科技攻关计划资助项目, No. 2002AA301C84.
通讯作者: 朱尤庆, 430071, 湖北省武汉市武昌区东湖路169号, 武汉大学中南医院消化内科. uqing_zhu@sina.com
电话: 027-87317915
收稿日期: 2003-08-23
修回日期: 2003-09-15
接受日期: 2003-10-22
在线出版日期: 2004-03-15

目的: 探讨6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子甲基化状况在胃癌发生、发展中的作用.

方法: 用甲基特异性聚合酶扩增链式反应检测20例正常胃黏膜组织、38例胃癌组织及癌旁正常组织DNA中MGMT基因启动子的甲基化状况, 用免疫组化方法检测MGMT 蛋白的表达情况.

结果: 19.1%(9/47)的肿瘤组织和10.6%(5/47)的癌旁正常组织存在MGMT基因启动子甲基化, 正常胃黏膜组织均不存在甲基化. 免疫组化发现有21.3%(10/47)的肿瘤组织MGMT蛋白失表达, 其中7例(70.0%)存在启动子甲基化. 胃癌中MGMT基因启动子高甲基化与MGMT蛋白表达缺失存在显著联系(P<0.001).

结论: 胃癌组织中存在一定程度的MGMT基因启动子高甲基化和MGMT蛋白表达缺失. 胃癌发生过程中MGMT基因高甲基化可导致MGMT蛋白表达缺失, 可能是胃癌发生的重要途径之一.

关键词: N/A
引文著录: 齐健, 朱尤庆, 杨冬, 张友才, 张蔚英, 刘军, 魏芸. 胃癌MGMT基因启动子CpG岛甲基化与蛋白表达缺失. 世界华人消化杂志 2004; 12(3): 751-753
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: August 23, 2003
Revised: September 15, 2003
Accepted: October 22, 2003
Published online: March 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)是一种普遍存在的DNA修复酶, 可将烷化剂使DNA鸟嘌呤O6位发生烷基化而形成O6-鸟嘌呤加合物从DNA上移除, 使细胞免受烷化剂的损伤, 并抑制随后的细胞反应, 使存在DNA损伤的细胞不再增生, 从而保持基因组的完整性[1]. MGMT基因启动子区域含有一个CpG岛, 若其CpG岛发生甲基化导致MGMT蛋白表达缺失或减少, 则烷化剂造成的损伤不能被及时修复, 在转录过程中会导致G: C配对转换为A: T配对(G→A转换), 使细胞发生癌性转化[2-6]. 我们检测了正常胃黏膜组织20例、胃癌组织47例及癌旁正常组织DNA中MGMT基因启动子甲基化状况和蛋白表达情况, 分析他们之间是否存在联系, 从而探讨MGMT基因启动子高甲基化在胃癌发生、发展中的作用.

1 材料和方法
1.1 材料

胃癌组织47例及相应的癌旁正常组织来自武汉大学中南医院外科手术患者, 男26例, 女21例, 年龄31-68(平均54.8岁). 癌旁组织为距肿瘤5 cm的正常组织, 经病理证实不存在不典型增生. 正常胃黏膜组织20名来自门诊的健康志愿者. 所有标本均取2份, 1份立即放入-70 ℃冰箱保存, 1份用甲醛固定、石蜡包埋后保存. 所有患者术前均未接受过放化疗.

1.2 方法

以传统的酚-氯仿方法从上述各种组织中提取DNA. 按James et al (Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 9821) [7]描述的方法用亚硫酸氢钠可对DNA进行化学修饰, 并用Wizard DNA纯化试剂盒(promega公司)纯化, 分别以MGMT基因甲基化和非甲基化引物进行扩增. 甲基化的引物序列上游为5'-TTT CGA CGT TCG TAG GTT TTC GC-3', 下游为5'-GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G-3'; 非甲基化的引物序列上游为5'-TTT GTG TTT TGA TGT TTG TAG GTT TTT GT-3', 下游为5'-AAC TCC ACA CTC TTC CAA AAA CAA AAC A-3'[8]. 反应条件为95 ℃预变性360 s, 然后94 ℃ 45 s, 59 ℃ 45 s, 72 ℃ 60 s, 35个循环后72 ℃延伸600 s[6,8]. PCR产物用8 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 硝酸银染色观察结果. 组织标本用甲醛固定、石蜡包埋, 制成4 m厚切片, 进行HE染色以确定其是否为肿瘤组织或正常组织及其病理类型和分期. 免疫组化使用鼠抗MGMT单克隆抗体和SP 试剂盒(北京中山公司). 以表达率大于10%为阳性结果.

统计学处理 用SPSS 11.0软件, Pearson x2检验, Fisher确切概率法, P<0.05认为有统计学意义.

2 结果

MSP结果显示, 正常胃黏膜组织均未显示甲基化条带, 19.1%(9/47)的胃癌组织和10.6%(5/47)的癌旁正常组织存在启动子甲基化. 5例甲基化的癌旁正常组织中有1例癌组织同时存在甲基化, 其余4例癌组织无甲基化(图1). 统计学分析显示, 胃癌组织中MGMT基因启动子甲基化率与癌旁正常组织之间的差异无显著性(x2= 1.343, P = 0.247), 而与正常胃黏膜(0/20)之间有差异(P = 0.049).

图1
图1 A: 癌组织(Ca)同时显示甲基化(M)和非甲基化条带(U), 正常胃黏膜(N)无甲基化条带, 体外甲基化的DNA(IVD)作为阳性对照; B: 36号癌组织和癌旁正常组织(P)都存在甲基化, 27号只有癌旁正常组织存在甲基化.

在20正常胃黏膜中MGMT蛋白在绝大多数实质细胞和间质细胞的胞核、胞质均有表达. 10例胃癌组织MGMT失表达, 其中7例存在MGMT启动子甲基化；癌旁正常组织蛋白表达均为阳性, 但有7例为弱阳性表达, 其中4例存在甲基化(图2). 统计学分析显示胃癌组织MGMT蛋白表达缺失率21.3%(10/47)与癌旁正常组织(0/47)、正常胃黏膜组织(0/20)之间的差异均有显著性(P = 0.001, P = 0.027). 并且MGMT启动子高甲基化与MGMT蛋白表达缺失存在显著联系(表1, x2=17.249, P<0.001).

表1 胃癌组织MGMT甲基化及蛋白表达情况.
免疫组化MSP
合计
非甲基化甲基化
+35237
-3710
合计38947
P<0.001.
图2
图2 免疫组化检测组织标本中MGMT的表达. A: 正常胃黏膜组织MGMT强阳性表达; B: 甲基化的癌旁正常组织中MGMT表达减弱; C: 胃癌组织中MGMT表达缺失.
3 讨论

N-亚硝基化合物可能是引起胃癌的主要化学致癌物, 可以在人胃中由其前体合成, 最终活性形式烷基正离子可使DNA发生烷基化. 鸟嘌呤O6位甲基化可以影响碱基配对, 且修复缓慢, 因而对致突变和致癌十分重要. MGMT是惟一能将O6-鸟嘌呤加合物从DNA上移除的蛋白, 若其表达减少或缺失, 则不能有效地修复该损伤, 使细胞失去了对烷化剂等突变原的保护性. 人类基因组中约有29 000个CpG岛, 几乎总是存在于基因启动子和(或)外显子周围, 除了印迹基因和女性失活的X染色体上的几个基因外, CpG双核苷酸在正常情况下都是非甲基化的, 而大多数CpG岛以外的CpG双核苷酸则是甲基化的[9-10]. 许多肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛在正常情况下是非甲基化的, 而在肿瘤组织中被高度甲基化[11-13]. 本组中, 有19.1%(9/47)的胃癌组织存在MGMT基因启动子甲基化, 而在正常胃黏膜组织中均未检测到甲基化, 与国外文献[8,14]报道相近. 提示在胃癌中存在较高频率的MGMT基因启动子甲基化. 启动子高甲基化能抑制基因转录, 导致蛋白表达缺失或减少. 我们同时用免疫组化方法检测了标本中MGMT蛋白的表达情况, 结果显示: 47例胃癌组织中有10例MGMT表达缺失, 而癌旁正常组织和正常胃黏膜组织中均无MGMT表达缺失, 表明MGMT在胃癌中表达缺失. 9例存在MGMT基因启动子甲基化的胃癌组织中有7例蛋白表达缺失, 表明MGMT基因启动子高甲基化与MGMT蛋白表达缺失有显著联系. 本研究中胃癌组织的甲基化率19.1%(9/47)和相应的癌旁正常组织10.6%(5/47)并无差异. 由于MSP是一种敏感性非常高的检测方法, 只要样本中有很微量的甲基化DNA就可以观察到甲基化条带. 一种可能是在取组织时癌旁正常组织被癌细胞污染, 若癌细胞存在甲基化, 则被污染的癌旁正常组织也出现甲基化条带. 另一种可能是这些癌旁正常组织细胞DNA中已存在一定程度的甲基化, 但尚未引起细胞癌变, 36号癌组织和癌旁正常组织都存在甲基化, 但都表达MGMT蛋白, 癌旁组织甲基化条带更浓, 与电泳点样量有关. 本组中5例存在甲基化的癌旁正常组织中有4例免疫组化表现为弱阳性, 表明这些组织中MGMT蛋白表达减少, 一个MGMT分子只能修复一处烷基化损伤, MGMT蛋白表达减少将使细胞的修复能力降低, 提示MGMT基因甲基化改变可能很早就已经出现, 可能是胃癌发生过程中的早期分子事件, 其后续变化可能在胃癌的发生、发展过程中起重要作用.

启动子甲基化抑制基因转录的机制尚不清楚, 但已有多项研究表明蛋白表达缺失或减少与基因启动子甲基化有关[15-19]. 我们的研究表明胃癌中存在一定程度的MGMT基因启动子高甲基化和MGMT蛋白表达缺失, MGMT基因表达缺失多由MGMT基因启动子高甲基化引起, 可能是胃癌发生过程中的早期分子事件. 胃癌在我国常见也是表现出高频率甲基化的肿瘤之一, p16INK4a、p14ARF、hMLH1、APC等基因在胃癌中均存在一定程度的甲基化[14,20-25], 因此联合检测MGMT基因和其他肿瘤相关基因的甲基化状况, 可能作为早期发现胃癌的分子标志物.

编辑: N/A

1.  Dolan ME, Schilsky RL. Silence is golden: gene hypermethylation and survival in large-cell lymphoma. J Natl Cancer Inst. 2002;94:6-7.  [PubMed]  [DOI]
2.  Fang JY, Lu J, Chen YX, Yang L. Effects of DNA methylation on expression of tumor suppressor genes and proto-oncogene in human colon cancer cell lines. World J Gastroenterol. 2003;9:1976-1980.  [PubMed]  [DOI]
3.  Yue CM, Deng DJ, Bi MX, Guo LP, Lu SH. Expression of ECRG4, a novel esophageal cancer-related gene, downregulated by CpG island hypermethylation in human esophageal squamous cell carcinoma. World J Gastroenterol. 2003;9:1174-1178.  [PubMed]  [DOI]
4.  Fang JY, Lu YY. Effects of histone acetylation and DNA methylation on p21(WAF1) regulation. World J Gastroenterol. 2002;8:400-405.  [PubMed]  [DOI]
5.  Esteller M, Risques RA, Toyota M, Capella G, Moreno V, Peinado MA, Baylin SB, Herman JG. Promoter hypermethylation of the DNA repair gene O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase is associated with the presence of G:C to A:T transition mutations in p53 in human colorectal tumorigenesis. Cancer Res. 2001;61:4689-4692.  [PubMed]  [DOI]
6.  Park TJ, Han SU, Cho YK, Paik WK, Kim YB, Lim IK. Methylation of O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase gene is associated significantly with K-ras mutation, lymph node invasion, tumor staging, and disease free survival in patients with gastric carcinoma. Cancer. 2001;92:2760-2768.  [PubMed]  [DOI]
7.  Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:9821-9826.  [PubMed]  [DOI]
8.  Bae SI, Lee HS, Kim SH, Kim WH. Inactivation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter CpG island hypermethylation in gastric cancers. Br J Cancer. 2002;86:1888-1892.  [PubMed]  [DOI]
9.  刘 仲敏, 刘 芝华, 吴 旻. DNA高甲基化与抑癌基因. 世界华人消化杂志. 2003;11:1420-1424.  [PubMed]  [DOI]
10.  周 永宁, 徐 采朴, 房 殿春. CpG岛甲基化与胃肠道肿瘤. 世界华人消化杂志. 2003;11:65-71.  [PubMed]  [DOI]
11.  Costello JF, Plass C. Methylation matters. J Med Genet. 2001;38:285-303.  [PubMed]  [DOI]
12.  Baylin SB, Esteller M, Rountree MR, Bachman KE, Schuebel K, Herman JG. Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in cancer. Hum Mol Genet. 2001;10:687-692.  [PubMed]  [DOI]
13.  朱 卫国. DNA甲基化, 基因调控和癌症. 世界华人消化杂志. 2002;10:680-683.  [PubMed]  [DOI]
14.  Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res. 2001;61:3225-3229.  [PubMed]  [DOI]
15.  Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, Baylin SB, Herman JG. Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia. Cancer Res. 1999;59:793-797.  [PubMed]  [DOI]
16.  Oue N, Shigeishi H, Kuniyasu H, Yokozaki H, Kuraoka K, Ito R, Yasui W. Promoter hypermethylation of MGMT is associated with protein loss in gastric carcinoma. Int J Cancer. 2001;93:805-809.  [PubMed]  [DOI]
17.  Liu LH, Xiao WH, Liu WW. Effect of 5-Aza-2'-deoxycytidine on the P16 tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma cell line HepG2. World J Gastroenterol. 2001;7:131-135.  [PubMed]  [DOI]
18.  Cui J, Yang DH, Bi XJ, Fan ZR. Methylation status of c-fms oncogene in HCC and its relationship with clinical pathology. World J Gastroenterol. 2001;7:136-139.  [PubMed]  [DOI]
19.  Liao C, Zhao MJ, Zhao J, Song H, Pineau P, Marchio A, Dejean A, Tiollais P, Wang HY, Li TP. Mutation analysis of novel human liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2003;9:89-93.  [PubMed]  [DOI]
20.  Ding Y, Le XP, Zhang QX, Du P. Methylation and mutation analysis of p16 gene in gastric cancer. World J Gastroenterol. 2003;9:423-426.  [PubMed]  [DOI]
21.  Zhao P, Hu YC, Talbot IC. Expressing patterns of p16 and CDK4 correlated to prognosis in colorectal carcinoma. World J Gastroenterol. 2003;9:2202-2206.  [PubMed]  [DOI]
22.  Yi J, Wang ZW, Cang H, Chen YY, Zhao R, Yu BM, Tang XM. p16 gene methylation in colorectal cancers associated with Duke's staging. World J Gastroenterol. 2001;7:722-725.  [PubMed]  [DOI]
23.  Deng DJ, Zhou J, Zhu BD, Ji JF, Harper JC, Powell SM. Silencing-specific methylation and single nucleotide polymorphism of hMLH1 promoter in gastric carcinomas. World J Gastroenterol. 2003;9:26-29.  [PubMed]  [DOI]
24.  Fang DC, Wang RQ, Yang SM, Yang JM, Liu HF, Peng GY, Xiao TL, Luo YH. Mutation and methylation of hMLH1 in gastric carcinomas with microsatellite instability. World J Gastroenterol. 2003;9:655-659.  [PubMed]  [DOI]
25.  张 晓兵, 刘 泽军. 胃癌DNA甲基化谱研究进展. 世界华人消化杂志. 2002;10:1454-1457.  [PubMed]  [DOI]