幽门螺杆菌 H. pylori Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-03-15; 12(3): 626-629
在线出版日期: 2004-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i3.626
小鼠H. pylori长期感染模型研究
陶好霞, 刘纯杰, 刘秀丽, 李淑琴, 李勣, 张兆山
陶好霞, 刘纯杰, 刘秀丽, 李淑琴, 李勣, 张兆山, 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 北京市 100071
陶好霞, 女, 1968-08-06生, 河南省鄢陵县人, 汉族. 1989年医学检验专科毕业, 军事医学科学院生物工程研究所实验师. 主要从事H. pylori疫苗的研制, 发表论文7篇.
基金项目: 国家"十五"863高技术研究发展计划基金资助项目, No. 2001AA215161.
通讯作者: 刘纯杰, 100071, 北京市, 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所. liucj@nic.bmi.ac.cn
电话: 010-66948834 传真: 010-63833521
收稿日期: 2003-08-28
修回日期: 2003-09-25
接受日期: 2003-10-22
在线出版日期: 2004-03-15

目的: 用H. pylori SS1 (Sydney strain1)感染C57BL/6小鼠及Balb/c小鼠, 建立稳定的H. pylori 感染的小鼠实验动物模型.

方法: 通过灌胃的方式用H. pylori SS1菌株感染二级C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠, 灌胃后4、12及24 wk分三次处死动物, 用胃黏膜匀浆液进行细菌培养试验、尿素酶试验、胃病理组织学检查以及血清学抗体检测试验.

结果: 灌胃4 wk后, 处死的7只Balb/c小鼠经胃组织细菌培养发现有6只显示阳性结果; 处死的7只C57BL/6小鼠中有5只显示阳性结果. 12和24 wk后的实验组7只Balb/c小鼠胃组织细菌培养均为阳性, 而7只C57BL/6小鼠中有6只显示阳性结果. 在不同阶段尿素酶检测的阳性结果与细菌培养法结果一致. 实验组动物胃窦部及胃体部均出现了轻度至中度慢性活动性胃炎变化; 血清学IgG检查表明, 各实验组的实验动物产生了抗H. pylori血清抗体; 而对照组动物的胃黏膜匀浆液经各项检测均为阴性.

结论: 成功地建立了H. pylori感染的小鼠实验动物模型.

关键词: N/A
引文著录: 陶好霞, 刘纯杰, 刘秀丽, 李淑琴, 李勣, 张兆山. 小鼠H. pylori长期感染模型研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(3): 626-629
Establishment of mouse models with long-term infection of H. pylori
Hao-Xia Tao, Chun-Jie Liu, Xiu-Li Liu, Shu-Qin Li, Ji Li, Zhao-Shan Zhang
Hao-Xia Tao, Chun-Jie Liu, Xiu-Li Liu, Shu-Qin Li, Ji Li, Zhao-Shan Zhang, Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
Supported by: National Foundation of the Advanced Technique Research and Development Project, No. 2001AA215161.
Correspondence to: Dr. Chun-Jie Liu, Institute of Biotechnology, Beijing 10071, China. liucj@nic.bmi.ac.cn
Received: August 28, 2003
Revised: September 25, 2003
Accepted: October 22, 2003
Published online: March 15, 2004

AIM: To develop a mouse model with long-term infection of H. pylori.

METHODS: Each mouse was inoculated with H. pylori Sydney strain 1 (SS1). Noninfected control mice and infected mice were killed at 4, 12 and 24 wk after H. pylori infection. A piece of gastric mucosa obtained from the posterior wall of the antrum of each mouse was used for culture of H. pylori, rapid urease testing and histopathological detection. Serum was obtained to measure the IgG antibody level to H. pylori.

RESULTS: After 4 wk of infection, the H. pylori was cultured from 6 of 7 infected Babl/c mice and 5 of 7 the H. pylori-infected C57BL/6 mice. After 12 and 24 wk of infection, all of 7 infected Babl/c and 6 of 7 the H. pylori-infected C57BL/6 mice showed the positive results. At the different wk, the rapid urease test results were consistent with the H. pylori culture test. At 12 wk after inoculation, chronic inflammation was observed in the pyloric mucosa by histopathological examination. At 24 wk after inoculation, lymphoid follicles were especially conspicuous in the submucosa, and they were also found in the deep portion of the mucosa.

CONCLUSION: H. pylori SS1 can colonize easily in the glandular stomach mucosa of mouse, and the histopathological changes are similar to those of humans with H. pylori infection.

Key Words: N/A
0 引言

H. pylori感染可导致人体发生慢性活动性胃炎和胃、十二指肠的消化性溃疡等, 同时有诱发机体发生胃癌的危险[1-5]. H. pylori的感染率极高, 在发达国家50%以上的成年人感染该菌, 发展中国家的感染率达到60%-80%, 甚至更高[6-10]. 调查表明, 90%的胃炎和70%的胃溃疡由H. pylori引起, 而且H. pylori感染所致疾病的治疗尚未得到很好的解决[11-14]. 目前, H. pylori的致病机制仍然不十分清楚, 从根本上解决防治H. pylori相关性疾病的首要方法是H. pylori疫苗的研制和临床应用, 而建立稳定的动物模型是探讨H. pylori致病机制及开展特异性免疫预防与治疗的前提和保证[15-16]. 现在建立的动物模型虽然不少, 但是方便而价廉的H. pylori小鼠模型的建立还少有报道. 我们通过灌胃的方式用H. pylori SS1菌株感染二级C57BL/6小鼠和Bal b/c小鼠, 表明H. pylori SS1菌株可长期定植于Balb/c和C57BL/6小鼠胃黏膜, 并发生了胃黏膜炎症变化, 成功地建立了H. pylori感染的小鼠实验动物模型, 为H. pylori致病机制的研究、疫苗开发研制等奠定了一定基础. 结果如下.

1 材料和方法
1.1 材料

二级C57BL/6小鼠及Balb/c小鼠各30只, 17-20 g, ♀; 由本院实验动物中心提供, 本所动物房饲喂. H. pylori SS1 (Sydney strain1)由广州中山医科大学陈旻湖教授惠赠.

1.2 方法

每种动物随机分成实验组(21只)和对照组(9只). 动物灌胃前进行8 h禁食和4 h禁水, 然后用30 mg/L NaHCO3 0.25 mL灌胃, 30 min后用1×109 cfu/L H. pylori SS1 0.5 mL灌胃, 灌后30 min恢复进食和饮水[17]. 对照动物灌服PBS. 隔日连续灌服3次. 末次灌胃后的4、12及24 wk分3次, 每次7只, 眼球放血并处死动物. 于无菌超净台中取出处死动物的胃, 用灭菌生理盐水清洗胃中内容物, 沿胃大弯将胃黏膜纵切为两半, 其中一半置于甲醛液体中常规固定, 用于病理组织学检查; 另一半用剪刀剪碎后(剪碎前称质量), 各加生理盐水0.5 mL于研磨器中研磨至匀浆进行细菌培养计数, 并用H. pylori快速检测试剂盒进行H. pylori尿素酶检测. 采用空肠弯曲菌琼脂基础培养基(其中含10 mg/L盐酸万古霉素, 2.5 mg/L多黏菌素B, 2 mg/L两性霉素B及75 ml/L脱纤维羊血)制平板, 将已研磨的匀浆用布氏肉汤分别稀释10、100、1 000倍, 取稀释液100 L涂平板, 37 ℃微需氧(50 mL/L O2, 100 mL/L CO2, 850 mL/L N2)培养72 h. 挑取呈细小圆形、半透明菌落, 经Gram染色后, 于油镜下观察菌体形态. 从细菌培养平板上挑取呈细小圆形、半透明菌落, 用胃H. pylori快速检测试剂盒HPUT-H104 (购自福建三强公司)检测, 能使试剂变为橙色的为阳性菌落[18].

胃黏膜经常规甲醛液体固定、梯度乙醇脱水、二甲苯脱乙醇、石蜡包埋切片、脱蜡、梯度复水、HE染色、梯度脱水、二甲苯透明及树脂封片后, 于光学显微镜下观察胃组织病理改变[19]. 动物眼球取血后, 将血液收集于1.5 mL离心管中, 常温下静置, 离心收集血清. 用酶联免疫黏附试验(ELISA)测定血清中抗H. pylori IgG抗体.

2 结果
2.1 细菌分离培养及尿素酶试验

在H. pylori感染后4、12及24 wk, 分批处死实验组的小鼠, 在胃组织中分离到典型H. pylori, 平板培养的菌落呈圆形、凸起、光滑、半透明状. 经Gram染色后于油镜下观察, 其中被染成红色、呈弯曲螺旋状的菌体, 与在实验室中培养的H. pylori标准菌株形态一致(图1). 对照组的胃黏膜匀浆液中则未分离到典型H. pylori菌落. 通过进一步的细菌分离培养, 对每块平板进行计数, 结果见表1. 实验组及对照组小鼠的胃黏膜匀浆液均进行快速尿素酶检测, 结果见表2.

表1 菌落计数结果.
小鼠类型处理时间Balb/c
C57BL/6
处死小鼠只数检出阳性只数H. pylori 菌数/克胃组织(mean±SD)处死小鼠只数检出阳性只数H. pylori 菌数/克胃组织(mean±SD)
4 wk761.44×106±19.48751.12×106±18.33
12 wk771.25×106±25.61761.53×106±32.41
24 wk771.03×106±57.22761.84×106±26.75
图1
图1 H. pylori感染后4 wk小鼠胃部分离的H. pylori SS1菌体形态. A: 标准株; B: 分离株.
表2 H. pylori感染小鼠尿素酶检测结果.
处理时间(wk)尿素酶检测阳性(%)
Balb/cC57BL/6
485.771.4
1210085.7
2410085.7
2.2 病理组织学检查

H. pylori实验组于12 wk在胃门前区小弯处可见有慢性炎症变化, 即有多量的淋巴细胞和嗜中性粒细胞浸润. 24 wk时炎症更加严重, 浸润细胞主要是淋巴细胞. 而对照组小鼠胃则未发现有炎性细胞浸润现象(图2).

图2
图2 H. pylori感染24 wk小鼠胃黏膜见大量淋巴细胞浸润(HE染色)×400.
2.3 血清抗体测定

采用ELISA法检测小鼠血清中的抗H. pylori IgG抗体水平. 其中抗原包被液为 H. pylori超声粉碎抗原, 浓度为10 mg/L, 每孔各加100 L. 以对照组小鼠的血清作为对照, 一抗进行了1: 1 000倍稀释, 二抗为HRP-兔抗鼠IgG抗体. 在各时间点H. pylori实验组血清中抗H. pylori的IgG抗体水平明显高于对照组(P<0.01), 说明小鼠已感染了H. pylori (表3).

表3 H. pylori实验小鼠血清中抗H. pylori IgG水平(mean±SD).
t /wk对照组H. pylori实验组
40.019±0.0040.080±0.021
120.027±0.0170.102±0.024
240.022±0.0130.113±0.022
3 讨论

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)作为各种慢性胃病、慢性胃炎、消化性溃疡的重要病因, 已得到公认. 近年来世界各国对H. pylori感染的免疫预防和免疫治疗的研究越来越重视, 而良好的动物感染模型的建立是该研究的前提基础. 尽管恒河猴、平顶猴、蒙古沙鼠及雪貂等是H. pylori的天然宿主, 但由于受价格贵、数量少、饲养条件高等因素限制, 不适宜于做理想的动物模型研究[20-23]. 迄今只有少数动物感染成功.

虽然国外采用某些实验动物如悉生小猪、胸腺机能正常或异常的无菌小鼠等做H. pylori动物模型, 但这些动物不易大量获得, 也不能用于免疫学研究[24-25]. 目前国际上公认的比较成熟的动物模型为Lee et al[26]所建立的 Helicobacter felis (Hf)小鼠模型, 但不能直接反应H. pylori疫苗的效果, 不完全适用于H. pylori疫苗免疫效果的评价. Karita et al[27]也曾建立了H. pylori的裸鼠感染模型, 而裸鼠本身免疫功能异常, 无法反映正常的免疫反应过程. 国内有诸多研究人员用不同的动物进行了感染模型的研究, 常用的有狗、大鼠、沙鼠等, 但感染率不是很理想, 并且感染的稳定性和重复性尚存在不同程度的问题[28-30].

小鼠体型小、易繁殖、来源便利、属系多样, 是作为动物模型的较好材料[31-35]. 我们经实验研究表明, 采用H. pylori SS1菌株能成功感染Balb/c和C57BL/6小鼠, H. pylori实验组胃黏膜匀浆液尿素酶检测试验结果: H. pylori感染4 wk时Balb/c组阳性率为85.7%, C57BL/6组阳性率为71.4%, H. pylori感染12 wk及24 wk时, Balb/c组阳性率均为100%, C57BL/6组阳性率平均为85.7%, 并且能从感染小鼠分离到与H. pylori标准菌株形态一致的菌落; 而对照组小鼠尿素酶检测为阴性, 且不能分离到典型H. pylori菌落. 实验组动物胃窦部及胃体部均出现了轻度至中度慢性活动性胃炎变化, 而对照动物均未见炎症变化. 血清学IgG检查表明, 实验组动物产生了抗H. pylori血清抗体, 而对照动物血清抗体阴性. 这里应指出的是, 在我们的实验中也出现了个别小鼠细菌分离阴性而血清抗体IgG检测呈阳性的情况, 我们初步分析原因为, 由于该鼠也同样经过了用H. pylori菌液灌胃三次的实验步骤, 即至少说也经历了外源细菌的感染过程, 因而也产生了抗H. pylori抗体. 只不过可能由于个体差异或其他原因, H. pylori在其胃内没有能够长期定植和繁殖, 或者是由于定植密度太低而未能分离检测到.

以上结果表明, 我们已成功建立了H. pylori的小鼠动物模型, 这对于H. pylori的致病机制研究、疫苗开发研制等具有重要意义.

编辑: N/A

1.  Shimoyama T, Fukuda Y, Sakagami T. The present status and problems of Helicobacter pylori eradication therapy with a special reference to gastric cancer. Nippon Rinsho. 2003;61:137-145.  [PubMed]  [DOI]
2.  Nishibayashi H, Kanayama S, Kiyohara T, Yamamoto K, Miyazaki Y, Yasunaga Y, Shinomura Y, Takeshita T, Takeuchi T, Morimoto K. Helicobacter pylori-induced enlarged-fold gastritis is associated with increased mutagenicity of gastric juice, increased oxidative DNA damage, and an increased risk of gastric carcinoma. J Gastroenterol Hepatol. 2003;18:1384-1391.  [PubMed]  [DOI]
3.  Suleymanov Z. Expression of class I and II MHC receptors in Helicobacter pylori-positive patients with active gastritis and duodenal ulcer. Turk J Gastroenterol. 2003;14:168-172.  [PubMed]  [DOI]
4.  Wong JE, Ito Y, Correa P, Peeters KC, van de Velde CJ, Sasako M, Macdonald J. Therapeutic strategies in gastric cancer. Clin Oncol. 2003;21:267s-269s.  [PubMed]  [DOI]
5.  Yanai A, Hirata Y, Mitsuno Y, Maeda S, Shibata W, Akanuma M, Yoshida H, Kawabe T, Omata M. Helicobacter pylori induces antiapoptosis through buclear factor-kappaB activation. J Infect Dis. 2003;188:1741-1751.  [PubMed]  [DOI]
6.  Loughlin MF. Novel therapeutic targets in Helicobacter pylori. Expert Opin Ther Targets. 2003;7:725-735.  [PubMed]  [DOI]
7.  Perri F, Qasim A, Marras L, O'Morain C. Treatment of Helicobacter pylori infection. Helicobacter. 2003;8:53-60.  [PubMed]  [DOI]
8.  Lamarque D, M Peek R Jr. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Helicobacter. 2003;8:21-30.  [PubMed]  [DOI]
9.  Nardone G, Morgner A. Helicobacter pylori and gastric malignancies. Helicobacter. 2003;8:44-52.  [PubMed]  [DOI]
10.  Robertson MS, Clancy RL, Cade JF. Helicobacter pylori in intensive care: why we should be interested. Intensive Care Med. 2003;29:1881-1888.  [PubMed]  [DOI]
11.  Watanabe H, Yamaguchi N, Kuwayama H, Sekine C, Uemura N, Kaise M, Nakamura T, Kubo M, Yoshida S, Haruma K. Improvement in gastric histology following Helicobacter pylori eradication therapy in Japanese peptic ulcer patients. J Int Med Res. 2003;31:362-369.  [PubMed]  [DOI]
12.  Leung WK, Graham DY. Ulcer and gastritis. Endoscopy. 2001;33:8-15.  [PubMed]  [DOI]
13.  Jimenez FP, Estevez MP. Role of cytokines in chronic gastritis by Helicobacter pylori. Acta Gastroenterol Latinoam. 2001;31:137-141.  [PubMed]  [DOI]
14.  Tytgat G. Helicobacter pylori: past, present and future. J Gastroenterol Hepatol. 2000;15:G30-33.  [PubMed]  [DOI]
15.  Fujioka T, Murakami K, Kodama M, Kagawa J, Okimoto T, Sato R. Helicobacter pylori and gastric carcinoma-from the view point of animal model. Keio J Med. 2002;51:69-73.  [PubMed]  [DOI]
16.  Sugiyama T, Hige S, Asaka M. Development of an H. pylori-infected animal model and gastric cancer: recent progress and issues. J Gastroenterol. 2002;37:6-9.  [PubMed]  [DOI]
17.  Enno A, O'Rourke JL, Howlett CR, Jack A, Dixon MF, Lee A. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. Am J Pathol. 1995;147:217-222.  [PubMed]  [DOI]
18.  Oyedeji KS, Smith SI, Arigbabu AO, Coker AO, Ndububa DA, Agbakwuru EA, Atoyebi OA. Use of direct Gram stain of stomach biopsy as a rapid screening method for detection of Helicobacter pylori from peptic ulcer and gastritis patients. J Basic Microbiol. 2002;42:121-125.  [PubMed]  [DOI]
19.  Ross JS, Bui HX, del Rosario A, Sonbati H, George M, Lee CY. Helicobacter pylori Its role in the pathogenesis of peptic ulcer disease in a new animal model. Am J Pathol. 1992;141:721-727.  [PubMed]  [DOI]
20.  Konturek PC, Brzozowski T, Konturek SJ, Kwiecien S, Pajdo R, Drozdowicz D, Stachura J, Karczewska E, Hahn EG. Functional and morphological aspects of Helicobacter pylori-induced gastric cancer in Mongolian gerbils. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003;15:745-754.  [PubMed]  [DOI]
21.  Radin MJ, Eaton KA, Krakowka S, Morgan DR, Lee A, Otto G, Fox J. Helicobacter pylori gastric infection in gnotobiotic beagle dogs. Infect Immun. 1990;58:2606-2612.  [PubMed]  [DOI]
22.  Dubois A, Fiala N, Heman-Ackah LM, Drazek ES, Tarnawski A, Fishbein WN, Perez-Perez GI, Blaser MJ. Natural gastric infection with Helicobacter pylori in monkeys: a model for spiral bacteria infection in humans. Gastroenterology. 1994;106:1405-1417.  [PubMed]  [DOI]
23.  Kagawa J, Honda S, Kodama M, Sato R, Murakami K, Fujioka T. Enterocromaffin-like cell tumor induced by Helicobacter pylori infection in Mongolian gerbils. Helicobacter. 2002;7:390-397.  [PubMed]  [DOI]
24.  Sjunnesson H, Sturegard E, Hynes S, Willen R, Feinstein R, Wadstrom T. Five mo persistence of Helicobacter pylori infection in guinea pigs. APMIS. 2003;111:634-642.  [PubMed]  [DOI]
25.  Cantorna MT, Balish E. Inability of human clinical strains of Helicobacter pylori to colonize the alimentary tract of germfree rodents. Can J Microbiol. 1990;36:237-241.  [PubMed]  [DOI]
26.  Lee A, Chen M, Coltro N, O'Rourke J, Hazell S, Hu P, Li Y. Long term infection of the gastric mucosa with Helicobacter species does induce atrophic gastritis in an animal model of Helicobacter pylori infection. Zentralbl Bakteriol. 1993;280:38-50.  [PubMed]  [DOI]
27.  Karita M, Kouchiyama T, Okita K, Nakazawa T. New small animal model for human gastric Helicobacter pylori infection: success in both nude and euthymic mice. Am J Gastroenterol. 1991;86:1596-1603.  [PubMed]  [DOI]
28.  Fujiwara Y, Higuchi K, Tominaga K, Matsuo T, Watanabe T, Uchida T, Saeki Y, Arakawa T, Tarnawski A. Effect of Helicobacter pylori culture supernatant on acute reflux esophagitis in a rat model. Hepatogastroenterology. 2001;48:1611-1615.  [PubMed]  [DOI]
29.  Yao YL, Xu B, Song YG, Zhang WD, Zhang YL, Zhang ZS. Effect of Helicobacter pylori infection on gastric mucosal cell proliferation in Mongolian gerbils. Diyi Junyi Daxue Xuebao. 2002;22:348-350.  [PubMed]  [DOI]
30.  Yan J, Hu AP, Li Q. Establishment of Helicobacter pylori infection model in Mongolian gerbil. Zhejiang Daxue Xuebao Yixueban. 2003;32:21-23.  [PubMed]  [DOI]
31.  Wang X, Willen R, Svensson M, Ljungh A, Wadstrom T. Two-year follow-up of Helicobacter pylori infection in C57BL/6 and Balb/cA mice. A PMIS. 2003;111:514-522.  [PubMed]  [DOI]
32.  Harris AG, Wilson JE, Danon SJ, Dixon MF, Donegan K, Hazell SL. Catalase (KatA) and KatA-associated protein (KapA) are essential to persistent colonization in the Helicobacter pylori SS1 mouse model. Microbiology. 2003;149:665-672.  [PubMed]  [DOI]
33.  Rabelo-Goncalves EM, Nishimura NF, Zeitune JM. Acute inflammatory response in the stomach of Balb/c mice challenged with coccoidal Helicobacter pylori. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002;97:1201-1206.  [PubMed]  [DOI]
34.  Kim DH, Kim SW, Song YJ, Oh TY, Han SU, Kim YB, Joo HJ, Cho YK, Kim DY, Cho SW. Long-term evaluation of mice model infected with Helicobacter pylori: focus on gastric pathology including gastric cancer. Aliment Pharmacol Ther. 2003;18:14-23.  [PubMed]  [DOI]
35.  Han SU, Kim YB, Joo HJ, Hahm KB, Lee WH, Cho YK, Kim DY, Kim MW. Helicobacter pylori infection promotes gastric carcinogenesis in a mice model. J Gastroenterol Hepatol. 2002;17:253-261.  [PubMed]  [DOI]