病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-03-15; 12(3): 614-617
在线出版日期: 2004-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i3.614
乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及人肝细胞株HL-7702转染
陈红英, 唐南洪, 张生君, 陈治新, 王小众
陈红英, 张生君, 陈治新, 王小众, 福建医科大学附属协和医院消化内科 福建省福州市 350001
唐南洪, 福建医科大学附属协和医院肝胆外科 福建省福州市 350001
陈红英, 女, 1975-12-04生, 福建省漳州市人, 汉族, 2001年福建医科大学协和医院消化内科硕士生, 主要从事肝脏疾病研究.
通讯作者: 王小众, 350001, 福建省福州市, 福建医科大学附属协和医院消化内科. drwangxz@pub6.fz.fj.cn
电话: 0591-3357896-8482
收稿日期: 2003-10-31
修回日期: 2003-11-05
接受日期: 2003-12-08
在线出版日期: 2004-03-15

目的: 构建表达乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株.

方法: 用PCR法扩增HBV X基因序列, 将其添A后连至PUCmT载体上, 用Ecol I和Hind III双酶切PUCmT-X和PcDNA3载体, 连接酶切片段PcDNA3及X片段以构建重组质粒PcDNA3-X. 用脂质体转染法将PcDNA3-X及空质粒PcDNA3导入肝细胞HL-7702中, G418选择培养, RT-PCR鉴定其稳定表达.

结果: 已构建的PcDNA3-X经序列测定含有完整的HBV X基因片段, 转入HL-7702细胞后经RT-PCR证实该细胞有稳定表达X蛋白.

结论: 成功构建了表达HBV X基因的肝细胞株, 为进一步探讨HBV X 基因在肝炎与肝癌发生中的作用提供了理想的实验模型.

关键词: N/A
引文著录: 陈红英, 唐南洪, 张生君, 陈治新, 王小众. 乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及人肝细胞株HL-7702转染. 世界华人消化杂志 2004; 12(3): 614-617
Construction of hepatitis B virus X gene expression vector in eucaryotic cells and its transfection in HL-7702 cells
Hong-Ying Chen, Nan-Hong Tang, Sheng-Jun Zhang, Zhi-Xin Chen, Xiao-Zhong Wang
Hong-Ying Chen, Sheng-Jun Zhang, Zhi-Xin Chen, Xiao-Zhong Wang, Department of Gastroenterology, Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Nan-Hong Tang, Department of Hepatobiliary Surgery, Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Correspondence to: Dr. Xiao-Zhong Wang, Department of Gastroenter-ology, Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China. drwangxz@pub6.fz.fj.cn
Received: October 31, 2003
Revised: November 5, 2003
Accepted: December 8, 2003
Published online: March 15, 2004

AIM: To establish a human hepatocyte cell line which can express hepatitis B virus (HBV) X gene.

METHODS: HBV X gene was obtained through PCR techn-ology. After A-tailing added, X gene was connected into vector PUCmT. Vector PUCmT-X and PcDNA3 were digested with EcoRI and HindIII. The fragments of X and PcDNA3 were connected to establish reconstituted plasmid PcDNA3-X. Then PcDNA3-X and PcDNA3 were transfected into HL-7702 cells by lipid-mediated transfection. After selected with G418, HL-7702/HBx cells were analysed by the reverse transcription-PCR to confirm the steady expression of X gene in HL-7702.

RESULTS: Reconstituted plasmid PcDNA3-X included the anticipated fragment of HBV X gene was proved by auto-sequencing assay. RT-PCR analysis showed that reconstituted plasmid PcDNA3-X could express the X protein efficiently in HL-7702 cells.

CONCLUSION: Hepatocyte can express HBV X gene, which is an ideal model to study the effect of HBV X gene on the development of hepatitis and hepatocelular carcinoma.

Key Words: N/A
0 引言

乙肝病毒(HBV)感染在我国较严重[1-9] , 已成为研究的热点. HBV X基因是HBV基因组中最小的一个开放读码框架, 编码基因区位于1 374-1 838核苷酸之间, 其编码的X蛋白由154个氨基酸组成. 目前认为HBV X基因及其产物在肝炎与肝癌的发生与发展中起重要的作用, 但具体机制尚未完全清楚[10]. 我们通过构建含X基因的真核表达载体并将其转染肝细胞L02, 以建立稳定表达HBV X基因的人肝细胞株, 为进一步探讨HBV X 基因在肝炎与肝细胞癌(HCC)发生中的作用提供了理想的实验模型.

1 材料和方法
1.1 材料

Taq DNA聚合酶、dNTP、胶回收试剂盒、添A试剂盒、 PUCmT载体与DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程服务有限公司; Ecol I 和Hind III内切酶, T4DNA连接酶, 质粒抽提试剂盒与脂质体转染试剂盒购自Promega公司; RNA抽提试剂盒购自深圳生物晶美公司; PcDNA3表达载体由本院风湿免疫研究所提供; 肝细胞株HL-7702和E.coli DH5由本院肝胆外科研究所提供; 其余生化试剂均为国产或进口的分析纯试剂.

1.2 方法

表达载体的构建: X基因扩增引物设计为上游: ATGCAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTACTG和下游: TGCGAATTCTTAGGC AGAGGTGAAAAAGTTG, 由上海生工生物工程服务有限公司合成. 用酚/氯仿抽提法从HBV感染患者血清中扩增出X基因片段. PCR扩增采用94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性45 s, 61 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 经30个循环. 将PCR产物添A后与PUCmT载体连接, 将连接产物PUCmT-X 转化入E.coli DH5中扩增, 抽提纯化PUCmT-X并测序. 选择正向连接的克隆提取质粒, 经Ecol I 和Hind III双酶切后连接于真核表达载体PcDNA3, 构建HBV X基因真核表达载体PcDNA3-X. 经PCR和酶切方法确认为重组载体后由上海生工生物工程服务有限公司测定序列. 酶切及连接方法参照分子克隆常规方法进行. 将肝细胞株HL-7702培养于含100 mL/L胎牛血清的DF培养基(DMEM: F12=3: 1)中. 选择状态良好的对数生长早期肝细胞HL-7702, 采用脂质体转染的方法(按脂质体转染试剂盒的说明书操作), 将重组质粒PcDNA3-X导入肝细胞HL-7702中, 同时将PcDNA3导入肝细胞HL-7702以作为空载体对照, 并以未进行基因转染的细胞为空白对照. 转染细胞经G418 600 mg/L选择培养2 wk后, 挑取单克隆扩增鉴定. 将转染有PcDNA3-X, PcDNA3的HL-7702分别命名为HL-7702/HBx和HL-7702/PcDNA3. 转染细胞X基因的鉴定: (1)细胞基因组中目的基因的检测 DNA抽提试剂盒提取HL-7702/HBx细胞的DNA, 用HBV X基因的引物进行PCR扩增, 以HL-7702/PcDNA3、HL-7702细胞作对照. HBV X基因扩增引物设计为上游: CCGTCTGTGCCTTCTCATCT 和下游: TAATCTCCTCCCCCAACTCC. PCR条件为94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性35 s, 65 ℃退火35 s, 72 ℃延伸1 min, 经32个循环. (1)RT-PCR鉴定X基因的表达. 用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA, 按试剂盒说明书进行RT反应, 取逆转录反应产物5 L作为模板, 用HBV X基因的引物进行PCR扩增, 仍以HL-7702/PcDNA3、HL-7702细胞作对照. HBV X基因的引物及PCR条件同上.

2 结果
2.1 HBV X的基因克隆

应用PCR技术从HBV感染患者的血清中扩增出HBV X基因片段. 特异性的电泳条带出现在500 bp左右, 与预计的470 bp相符(图1).

图1
图1 PCR扩增出HBV X基因片段. 1: 100 bp DNA ladder; 2: HBV X基因阳性片段; 3: 阴性对照.
2.2 X基因重组体的鉴定

PUCmT-X测序结果示X基因正向插入PUCmT载体, 故选用Ecol I 和Hind III双酶切PUCmT-X和PcDNA3载体. 用Ecol I 和Hind III对构建好的PcDNA3-X进行酶切分析, 以PcDNA3作对照, 电泳结果如预期, PcDNA3-X酶切后出现500 bp左右的X酶切片段(图2). PcDNA3-X的测序(图1)与X基因序列比较表明X基因真核表达载体构建成功.

图2
图2 PcDNA3-x双酶切鉴定结果. 1: 1 Kb DNA ladder; 2: PcDNA3-x双酶切产物; 3: PcDNA3双酶切产物.
2.3 转染细胞X基因的鉴定

提取HL-7702/HBx, HL-7702/PcDNA3, HL-7702细胞的DNA, 用HBV X基因的引物进行PCR扩增, HL-7702/HBx细胞扩增出特异的200 bp左右的片段, 说明HBV X基因已整合到细胞的基因组中. 提取三组细胞RNA, 经反转录合成cDNA后, PCR扩增, 可见HL-7702/HBx细胞有HBV X基因mRNA表达(图4). 表明HBV X基因已导入HL-7702细胞, 并有稳定表达.

图4
图4 RT-PCR检测HL-7702细胞HBV X mRNA转录. 1: 100 bp DNA ladder; 2: HL-7702/HBx; 3: HL-7702/PcDNA3; 4: HL-7702.
3 讨论

在我国, 乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起HCC的主要病因之一[11-17]. 流行病学调查表明, HBV感染者HCC的发病率较对照人群高出200倍以上[10-18]. 但HBV致HCC的具体机制一直未阐明. HBV X基因的致癌作用已成了研究的热点. HBV X基因的产物X蛋白大多存在于胞质中, 仅有一小部分在胞核内[19]. 他是一种多功能蛋白[20], 能作用于不同的目标(如: 转录因子, 细胞质激酶, 线粒体蛋白)[21], 可能通过转录激活作用、抑制DNA的修复、调控肝细胞凋亡而诱发肝癌形成和促进肝癌发展的[22]. 研究发现HBV X基因在少量表达时未显现出明显作用, 仅有当其表达产物积累到一定量, 聚集在一起时才起作用[23]. 但X基因并非癌基因, 不含有特异致癌基因序列[24]. 近几年来, 通过对转HBV X基因的肝细胞模型及小鼠动物模型的研究, 发现HBV X基因及产物X蛋白有以下生物学功能: (1)促进肝细胞凋亡, 诱导炎症的发生; (2)可与P53结合, 影响核苷的切补修复, 干扰细胞周期而促进肝癌细胞的增生[25]; (3)作用于细胞因子和信号传导途径: 上调NF-κB的表达并转位于胞核内[26-27]; 可激活[28]并上调肝癌细胞表达FasL; 能阻断Bcl-2 介导的肝Fas途径的调亡[29]; 能使Bid的表达减少而阻断细胞调亡[30]; 可通过增加内源性激活因子sn-1、2-DAG短暂地激活PKC[31]; 可有效地抑制TGF-引起的凋亡; 能激活JNK和 MAPK信号传导途径[32]; 能抑制capase3的活性; 能通过下调Sep蛋白的表达而增加TNF-的表达[33]; (4)能引起线粒体膜电位的丢失而引发线粒体依赖性的细胞死亡[34]; (5)能激活IGF-IR 和 VEGF 基因的表达, 以促进肿瘤的生长与侵袭.

以上研究多以转HBV X基因的肝癌细胞株(如HepG2、QGY7701、HCC9204等)和肝癌组织为对象, 探讨HBV X基因及其蛋白产物在肝癌细胞凋亡与增生的信号传导通路、癌基因的激活等方面所起的作用, 以进一步揭示HBV X基因在HBV相关性HCC形成与发展中的意义. 而对于X基因及其产物在正常肝细胞中的作用报道甚少, 其影响尚未阐明. 因为这些研究的对象本身即为肝癌细胞, 故实验结果仅能说明HBV X基因在促进HCC发展中的作用, 而难以解释其诱发肝炎和HCC形成的作用. 理想的研究对象应为正常肝细胞, 将X基因导入正常的肝细胞, 观察转染后的肝细胞的形态与生物学功能的变化能较直观、较全面地了解HBV X基因的生物学功能. 我们以肝细胞HL-7702为研究对象, 利用PcDNA3载体将HBV X基因导入HL-7702, 获得转HBV X基因的肝细胞株HL-7702/HBx, 并用PCR和RT-PCR结果证明HL-7702/HBx基因组中有HBV X基因的整合, 且有HBx mRNA的转录表达. 说明HL-7702/HBx是可稳定表达HBV X基因的肝细胞株, 他为进一步探讨HBV X 基因在肝炎和HCC发生、发展中的作用提供了一个理想的细胞模型.

编辑: N/A

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