尼美舒利对结肠癌细胞ICAM-1 mRNA表达的影响

摘要

目的: 初步研究尼美舒利对培养结肠癌细胞生长及其ICAM-1 mRNA表达的作用.

方法: 以人结肠癌细胞株HT-29, HCT-116为研究对象, 体外药物敏感试验(MTT)法检测尼美舒利对肿瘤细胞的增生抑制效应; RT-PCR方法检测尼美舒利作用前后细胞ICAM-1 mRNA表达的变化.

结果: 尼美舒利对结肠癌细胞HT-29、HCT-116生长抑制作用呈时间、剂量依赖性方式, 对HT-29细胞抑制效果强于HCT-116细胞.尼美舒利下调HT-29细胞ICAM-1 mRNA表达, 而对HCT-116细胞ICAM-1 mRNA的表达无显著作用.

结论: 尼美舒利可明显抑制结肠癌细胞HT-29生长, 提示NIM可能通过抑制COX-2酶活性, 下调细胞ICAM-1的表达, 从而降低癌细胞播散及转移几率.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 9, 2003
Revised: October 20, 2003
Accepted: November 19, 2003
Published online: February 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

研究发现非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)可抑制环氧合酶(cyclooxygenase, COX)活性, 拮抗结肠肿瘤形成.结肠癌的转移及复发可能与COX-2的高表达有关[1-2]. 细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)是体内重要的免疫活性分子, 有关ICAM-1与肿瘤侵袭转移的关系是近年来研究的热点[3]. 本试验应用COX-2选择性抑制剂-尼美舒利 (nimesulide, NIM) 作用于结肠腺癌细胞, 通过检测肿瘤细胞的增生及细胞ICAM-1 mRNA表达情况, 初步探讨COX-2选择性抑制剂对结肠癌侵袭转移的作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM培养基、小牛血清(Gibco公司)、MTT、DMSO、NIM(Sigma公司)、CO₂培养箱(Thermo Forma公司), 人结肠癌细胞株HT-29 (COX-2高表达)和HCT-116 (COX-2低表达).

1.2 方法

HT-29和HCT-116细胞于含100 mL/L小牛血清的DMEM液中培养, 置37 ℃, 50 mL/L CO₂培养箱中, 取对数生长期的细胞备实验之用.

1.2.1 体外药物敏感试验: 噻唑蓝(MTT)法: 取两种细胞接种于96孔板中, 加入NIM原液, 使终浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L, 设加溶剂DMSO对照组, 继续培养24 h、48 h和72 h, 加入MTT液, 孵育4 h后弃上清, 加入DMSO 150 μL, 轻轻振荡10 min, 测定各孔光吸收值(A值), 绘制细胞生长曲线. 计算药物对细胞的生长抑制率.

1.2.2 RT-PCR法检测ICAM-1表达变化: 两种细胞培养过夜后, 收集0 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L NIM作用72 h和200 μmol/L NIM作用12 h、24 h、48 h、72 h的细胞, 抽提细胞总RNA, 测定其A₂₆₀, A₂₆₀/A₂₈₀, 进行逆转录和PCR反应. 产物以琼脂糖凝胶电泳分离, 紫外光照下以UVP凝胶图像分析系统成像和定量分析.

统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件包进行统计学处理, 所得到的数值均以mean±SD表示.

2 结果

2.1 NIM对HT-29和HCT-116细胞增生的影响

MTT试验结果显示: 随NIM浓度的增加, 作用时间的延长, 药物对HT-29和HCT-116细胞生长抑制率明显增高.NIM对HT-29细胞的增生抑制效果较HCT-116细胞明显(图1).

图1 尼美舒利对结肠腺癌细胞株HT-29 (A)和HCT-116 (B)的增生抑制作用.

2.2 NIM不同浓度、不同培育时间对ICAM-1 mRNA表达的影响

HT-29和HCT-116细胞株均表达ICAM-1 mRNA, 对照组HT-29细胞表达较HCT-116细胞为高, 差异有显著性(P<0.05); NIM作用72 h的HT-29细胞, ICAM-1 mRNA表达量随药物浓度增加逐渐降低. 50 μmol/L NIM作用组与对照组相比有显著性差异(P<0.05), 100 μmol/L和200 μmol/L组与对照组差异更为显著(P<0.01).各NIM浓度组HCT-116细胞ICAM-1 mRNA表达无显著性差异. 200 μmol/L NIM作用于HT-29细胞24 h、48 h和72 h后, 细胞ICAM-1 mRNA表达与12 h组相比均有极其显著差异(P<0.01). 而同样浓度药物的HCT-116细胞不同作用时间组ICAM-1 mRNA表达则无显著性差异.

3 讨论

流行病学资料表明: 长期服用NSAIDs类药物可使罹患大肠癌危险性降低40-50%. COX-2受抑制可能是NSAIDs抗肿瘤作用的机制之一. COX-2为COX诱导性异构酶, 其过度表达可能是结肠肿瘤发生的早期事件, 并在诱导肿瘤血管生成和转移的过程中发挥重要作用. 我们采用MTT方法证实NIM可以时间、剂量依赖方式抑制结肠腺癌细胞的增生.

ICAM-1是一种跨膜蛋白, 通过与其配体淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD11a/CD18)和巨噬细胞相关复合体(Mac、CD11b/CD18)结合, 介导细胞与细胞之间的相互活动; 参与呈递抗原信息、激活细胞免疫等过程[4-5]. 正常情况下, ICAM-1仅在血管内皮细胞等细胞低水平的表达, 但在炎症、器官移植、肿瘤免疫等情况下表达量明显增多[6-8]. 研究发现, 结肠癌组织中有高水平ICAM-1的表达, 而癌旁组织和结肠腺瘤组织的表达水平较低, 原因可能为结肠癌细胞能自分泌或刺激邻近组织旁分泌ICAM-1[9]. 研究显示: 癌细胞通过表达ICAM-1作用于其配体LFA-1, 致肿瘤细胞间黏附力降低, 而与血管内皮细胞、淋巴细胞和胞外基质紧密结合, 易从原发灶脱落, 黏着到基质成分, 并可随淋巴细胞进入血液循环. 同时, ICAM-1的可溶性形式sICAM-1进入血液循环后, 竞争性抑制瘤细胞与T细胞与LFA-1的结合, 使肿瘤细胞逃避了免疫监视, 在肿瘤的转移过程中起了重要的作用[10-12]. 有研究者认为sICAM-1可作为结肠癌早期诊断及转移判断的有用指标[13]. 但是, 也有研究发现ICAM-1与肿瘤的侵袭和转移呈负相关. Yasuda et al[14]研究发现: 肿瘤细胞在转移起始阶段, 表达高水平的ICAM-1, 避免受到免疫攻击, 易于肿瘤细胞着床、形成转移灶; 当肿瘤细胞受到细胞外基质刺激时, 通过激活酪氨酸激酶途径, 下调ICAM-1表达, 增加sICAM-1的表达, 使肿瘤细胞免遭杀伤[15].

目前, 对COX-2是否影响ICAM-1表达, 进而影响结肠癌侵袭转移的相关研究目前国内外尚未见报道. 为探讨其作用机制, 我们采用RT-PCR方法检测NIM对肿瘤细胞ICAM-1 mRNA表达的影响, 结果显示: 随着NIM浓度增加, 作用时间延长, HT-29 细胞ICAM-1 mRNA表达水平逐渐降低; 而同样作用形式HCT-116细胞组别间ICAM-1 mRNA表达无显著差异. 结果提示结肠癌细胞COX-2与ICAM-1表达存在相关性, 说明NIM可能通过抑制COX-2酶活性的途径, 下调肿瘤细胞ICAM-1表达, 从而抑制结肠癌细胞生长, 削弱癌细胞与淋巴细胞和单核细胞的黏附, 加强同质细胞间的黏附, 降低癌播散及转移几率.

备注

编辑: N/A

参考文献

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