修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15
目的: 对新基因NS5A-TP4转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析, 探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.
方法: 应用生物信息学(bioinformatics)技术, 分析我室通过抑制性消减杂交技术筛选得到的新基因NS5A-TP4的全长编码序列, 并NS5A-TP4构建基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4. 应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.
结果: 确定基因NS5A-TP4由762 nt组成, 编码253 aa的蛋白. 基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因, NS5A-TP4表达质粒转染的细胞有18条差异表达基因, 其中12条基因表达增强, 6条基因表达降低. 这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、生长调节密切相关.
结论: 基因表达谱芯片技术可为初步探索新基因的功能提供重要的资料. 本实验结果为进一步阐明NS5A-TP4生物学功能及HCV-NS5A的致病机制提供了理论依据.
引文著录: 杨倩, 成军, 刘妍, 王建军, 洪源, 张树林. 基因表达谱芯片技术筛选NS5A-TP4蛋白反式调节基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 311-314
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004
AIM: To study the molecular mechanism of NS5A-TP4 in the up- and down-regulated genes of hepatocyte by cDNA microarray assay.
METHODS: HepG2 cells were transfected by recombined expression plasmid pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4. Total RNA was isolated from the transfected HepG2 cells with pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4, respectively. cDNA was prepared by reverse transcription. cDNA microarray was conducted for screening of up- and down-regulated genes of both HepG2 cells.
RESULTS: After screening with cDNA microarray, we found that 12 genes were up-regulated, and 6 genes down-regulated. Some of them were involved in cell signal transduction, cell proliferation, and carcinogenesis.
CONCLUSION: cDNA microarray is an important choice for the analysis of target genes of NS5ATP4 transactivation. The obtained sequences bring some new clues for studying the biological functions of NS5ATP4 and infection mechanism of HCV.
- Citation: Yang Q, Cheng J, Liu Y, Wang JJ, Hong Y, Zhang SL. Screening and identification of genes transactivated by NS5A-TP4 protein by cDNA microarray assay. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(2): 311-314
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i2/311.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i2.311
丙型肝炎病毒(HCV)是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒, 属黄病毒科肝炎病毒类. 在大多数感染人群中丙型肝炎病毒表现为持续性感染, 并可导致慢性肝炎、肝硬化, 或肝细胞癌. HCV基因组包括5'非编码区, 一个长约9 400 bp的单一 开放阅读框(open reading frame, ORF)和3'非编码区(3'non-encode region, 3'-NCR), 其中ORF包括结构区(structural region)和非结构区(nonstructural region), 在非结构基因区中有NS2, NS3, NS4A, NS5A和NS5B区等[1-2]. 近年来, HCV NS5A区的结构与功能倍受关注, 研究者发现在NS5A蛋白2209-2248 aa间存在一个与干扰素治疗效果紧密相关的区域, 称为"干扰素敏感决定区(interferon sensitivity determining region, ISDR)". 他们认为ISDR氨基酸序列的变异与IFN的应答率直接相关. 在体外实验中证实NS5A对于HCV体外复制有重要作用, 更为重要的是NS5A对细胞周期及细胞生长具有调节作用, 可能与慢性肝炎、肝细胞癌的发生发展有着密切的关系[3-5]. 我室利用SSH技术, 对于NS5A表达载体转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2的基因表达谱变化进行比较研究, 发现了NS5A蛋白可上调一些基因的表达. 其中包括未知功能基因, 命名为NS5ATP4[6-7]. 为了从不同的角度对NS5A的反式调节基因进行验证及研究, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)对NS5ATP4反式调节的靶基因进行了筛选, 为今后更加广泛深入地研究新基因NS5ATP4功能及NS5A的反式调节作用打下了基础.
人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存, 细胞培养相关试剂及总RNA提取试剂Trizol均购自Gibco公司, 脂质体转染试剂FuGENE6购自罗氏公司, NS5ATP4真核表达质粒由本室构建．
1.2.1 SSH筛选HCV-NS5A差异性显示cDNA文库: 具体方法、操作参考文献[8]．
1.2.2 细胞培养及取材: NS5ATP4真核表达质粒由本室构建. 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 分别以脂质体转染试剂FuGENE6将2 μg pcDNA3.1(-)-NS5ATP4和空载体pcDNA3.1(-) 转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5106个细胞加入1 mL Trizol试剂, 立即于液氮中保存[9-26]．
1.2.3 总RNA提取: 使用Trizol试剂一步法提取pcDNA 3.1(-)-NS5ATP4和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28 S、18 S条带变化.
1.2.4 探针标记: 参照Schena et al[27]方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5碨SC+0.2% SDS杂交液中.
1.2.5 芯片制备: 芯片包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000 bp-3 000 bp. 靶基因以0.5μg/ μL溶解于3碨SC溶液中,用Cartesian公司的Cartesian 7500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线交联, 再分别用0.2% SDS、水及0.2% 的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.
1.2.6 预杂交: 将预杂交液放入95 ℃水浴锅内变性2 min, 将待预杂交的芯片放入95 ℃水浴锅内变性30 s, 芯片取出后即放入无水乙醇中30 s, 晾干. 将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内, 盖上盖玻片, 放入杂交箱内42 ℃预杂交5-6 h.
1.2.7 杂交及洗涤: 将探针置于95 ℃水浴中变性2 min; 芯片置于95 ℃水浴中变性30 s, 芯片取出浸无水乙醇30 s, 探针取出后迅速置于冰上. 将探针置于芯片上, 用盖玻片覆盖, 置于杂交舱中, 用Parafilm密封, 放入42 ℃杂交箱内杂交过夜(16-18 h). 依次以2×SSC+ 0.2% SDS、0.1%×SSC +0.2% SDS、0.1%×SSC洗涤10 min, 室温晾干.
1.2.8 扫描与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.
cDNA文库为基础, 将其中一个新基因命名为NS5ATP4, 电子推定其编码的氨基酸序列, 以人肝癌细胞cDNA为模板, 对NS5ATP4进行了克隆化研究, 得到了NS5ATP4的编码的氨基酸序列．
总RNA的吸光度A260/A280>1.92, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h的电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA.
在芯片上共有1 152个cDNA. 为了监控芯片杂交体系, 在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1 152个基因中筛选出差异表达基因共18条, 其中12条基因表达增强(表1), 6条基因表达降低(表2).
| 编号 | Cy5/Cy3 | 基因名称 |
| 1 | 2.014 | NCK相关蛋白(NCKAP1) |
| 2 | 2.026 | 小诱导细胞因子A3(SCYA3) |
| 3 | 2.030 | 富含半胱氨酸的血管生成诱导因子(CYR61) |
| 4 | 2.081 | 来自BCRA2区域的猜想蛋白(CG005) |
| 5 | 2.154 | 肿瘤抑制亚转移物候选物1 |
| 6 | 2.226 | 未知功能基因FLJ21985 |
| 7 | 2.236 | 核转录因子NFκB1 |
| 8 | 2.326 | plexin C1 (PLXNC1) |
| 9 | 2.519 | 谷胱甘肽过氧化酶1(GPX1) |
| 10 | 2.655 | 细胞色素P450, 亚家族IID多肽6 |
| 11 | 2.699 | 硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1) |
| 12 | 3.169 | T细胞受体重排β链基因V区(V-D-J) |
| 编号 | Cy5/Cy3 | 基因名称 |
| 1 | 0.367 | 干扰素诱导的丙型肝炎相关微管聚合蛋白(MTAP44) |
| 2 | 0.410 | transgelin 2(TAGLN2) |
| 3 | 0.435 | G蛋白信号5调节子(RGS5) |
| 4 | 0.455 | HGF激活因子(HGFAC) |
| 5 | 0.467 | exostoses (multiple)-like 3 (EXTL3) |
| 6 | 0.496 | prefoldin 5(PFDN5) |
见表2.
基因芯片(gene chip)也称为DNA微距阵(DNA microarray)、DNA芯片(DNA chip)等, 是近年发展起来的一项前沿生物技术. 他是指将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地高密度地排列固定于玻片、硅片等固相载体上, 然后与待测的标记样品的基因按碱基互补配对原理进行杂交, 通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描, 再经计算机软件处理, 从而获取大量生命信息. 该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上, 所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析, 从而解决了传统核酸印记杂交(southern blotting和northern blotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足. 该技术的出现使全面综合分析某些生命现象成为可能[12].
HCV基因组的翻译是在有关酶的作用下合成一个长约3 011氨基酸的多蛋白前体, 然后在宿主信号肽酶和病毒编码的蛋白酶作用下裂解为各种蛋白. NS5A是非结构蛋白的一种, 哺乳动物细胞表达的NS5A蛋白以两种形式存在, 分子量分别为56 kD和58 kD, p58被认为是p56的超级磷酸化产物, 目前认为NS5A蛋白是在细胞蛋白激酶作用下发生磷酸化修饰后发挥生物调节作用的[13-14]. 近年研究发现, NS5A是转录反式激活因子, 其羧基末端富含酸性氨基酸及脯氨酸, 这是真核细胞转录因子特有的结构特征. 尽管NS5A蛋白是存在于胞质中, 但其具有功能性核定位信号(nucleic localization signal, NLS)序列, 即PPRKKRVV (354-362 aa), 因此有核信号转导功能. 研究者发现NS5A蛋白可以抑制细胞周期调节基因p21/WAF1的转录, 而后者是介导细胞凋亡的p53的下游效应基因, 说明NS5A对细胞凋亡有抑制作用, 对细胞生长有促进作用[15-18]. 我室利用SSH筛选出HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库, 对挑选的克隆进行分析发现其中一个新基因与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性. 电子拼接推定该基因的ORF获得相应的全长编码基因, 将该未知功能基因命名为NS5ATP4. 根据这一序列设计引物, 以人肝癌细胞cDNA为模板, PCR反应扩增NS5ATP4基因序列. 反应产物经测序完全符合计算机分析结果, 这表明我们已顺利得到了NS5ATP4编码序列. NS5ATP4的ORF长度为762 bp, 编码253个氨基酸残基, NS5ATP4基因的生物学功能及其在丙型肝炎发病机制中的作用目前还不清楚, 为进一步研究NS5ATP4的生物学功能, 我们利用基因芯片技术对其上调、下调基因进行分析[19]. 结果表明, 12种基因的表达水平上调, 6种基因的表达水平下调. 这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导、免疫调节、肿瘤发生等基因, 如: 细胞色素P450, HGF激活因子, 谷胱甘肽过氧化酶1, 肿瘤抑制亚转移物候选物1. CD95 (CD95/APO-1) 受体/CD95配体(CD95L)是调节不同细胞凋亡的关键信号传导系统. 表达水平上调的基因谷胱甘肽过氧化酶1能够阻断CD95诱导的凋亡, 保护细胞免受过氧化作用诱发的凋亡[20-21]. 表达水平上调的基因富含半胱氨酸的血管生成诱导因子(CYR61)是生长调节因子家族成员之一, 能够与细胞外基质、细胞表面受体结合促进细胞生长、迁移．研究者发现CYR61能够通过激活MAPK和Akt信号转导途径, 诱导胸壁肿瘤的形成及肿瘤血管化. 研究者亦发现CYR61是整合素受体的配体之一, 当配体与整合素受体结合可以介导细胞内外的信号传导, 从而激活五种与血管化有关的反应, 包括: 上皮细胞的黏附、迁移、增生、存活、血管化[22-25]．在下调表达的基因中, transgelin 2的缺失与肿瘤的发生密切相关, Shields et al[26-29]在研究胸壁及大肠肿瘤时, 发现癌基因Ras依赖于Raf和非依赖于Raf的信号转导中, Ras均抑制transgelin 2基因的表达[26-29]. 对新基因的研究及其功能的确定是分子生物学领域一项很具有挑战性的工作, 基因芯片技术是研究反式调节基因的有效技术[30-31].
本研究结果表明, NS5A-TP4对于肝细胞的基因表达谱有显著的影响, 他上调一些抑制细胞调亡或与细胞信号转导有关的基因表达, 为我们进一步深入研究NS5A-TP4的功能提供了理论依据, 并为HCV感染慢性化机制及HCV致癌机制提供了新的研究方向．
编辑: N/A
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