修回日期: 2004-10-30
接受日期: 2004-11-04
在线出版日期: 2004-12-15
目的: 观察益气健脾药物血清对离体脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体结合作用的影响并探讨其相关机制.
方法: 采用血清药理学方法和放射配基受体结合测定技术分别对正常、脾虚、药物血清作用后的大鼠壁细胞结合位点数进行检测, 并对补中益气汤含药血清抑制大鼠胃泌素与其受体结合的抑制率进行了测定.
结果: 脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体结合容量明显少于正常大鼠(876.0±88.2 vs 1 071.1±102.1, P<0.01); 补中益气汤药物血清作用后结合位点数明显上升(980.4±89.2 vs 876.0±88.2, P<0.05); 党参及白术药物血清组作用后结合位点数也有上升趋势, 但与脾虚组相比差异不显著; 补中益气汤含药血清部分抑制大鼠胃泌素与其受体的结合(抑制率 = 42.9%>30%).
结论: 益气健脾药物血清对脾虚大鼠的结合位点数下降具有上调作用; 其机制可能与其同胃泌素受体的竞争结合相关.
引文著录: 隋峰, 王汝俊, 王建华, 杜群, 许琦. 益气健脾药物血清对离体脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体结合作用的影响及机制. 世界华人消化杂志 2004; 12(12): 2871-2873
Revised: October 30, 2004
Accepted: November 4, 2004
Published online: December 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(12): 2871-2873
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i12/2871.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i12.2871
壁细胞是存在于胃黏膜上的高度分化的终末细胞, 由于壁细胞的培养不会传代, 且以每日5-10%的速度死亡[1-2], 因此对壁细胞的研究多数采用即时分离. 我室自1999年建立壁细胞的分离和纯化方法后, 对脾虚大鼠壁细胞在整体实验的基础上进行了一系列的研究. 为进一步深入探讨, 我们尝试采用血清药理学方法在原有整体实验的基础上对即时分离的脾虚及经益气健脾药物血清作用后的离体大鼠壁细胞胃泌素受体结合容量进行了测定, 并对其作用机制进行了初步探讨, 旨在从不同角度采用不同方法深入和全面阐释脾虚证的分子病理机制[3].
Sprague-Dawley♂大鼠, 体重200±20 g, 由广州中医药大学实验动物中心提供, 合格证号: scxk(粤)2003-0001. 试剂: 125I-胃泌素购自中国原子能科学研究院, 比活度为1 700 ci/mmol, 放化纯度大于95%. 胃泌素标准品及链霉蛋白酶由北京鼎国试剂公司提供(Sigma生产). 主要仪器及设备: 5500型γ计数器(Beckman), HYS-4多头细胞收集器(上海跃进医疗器械厂), HZS-H恒温水浴振荡器(哈尔滨东联电子有限公司), XDS-1倒置显微镜(重庆光电仪器厂), TDZ5-WS自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器公司), 多头磁力搅拌器(常州国华电器厂).
1.2.1 药物及含药血清的制备: 补中益气汤依中国药典的处方, 采用常规方法制备成100%水提液; 党参、白术制备成66%水提液. 按1 mL/100 g, 连续给药5 d, 1次/d, 空白血清组给予等量的生理盐水, 末次给药后2 h, 眶静脉丛穿刺采血, 室温静置2 h后, 3 000 r /min、10 min、离心分离血清, 0.22微孔滤膜过滤除菌, 置冰箱中保存备用[4-5].
1.2.2 动物分组及模型的制备: 大鼠随机分成正常和脾虚模型组, 模型的制备采用我室常规方法, 用100%的大黄浸液灌胃, 按1 mL/100 g, 连续给药10 d, 2次/d, 正常组给予等量的生理盐水. 以上各组均常规喂养, 自由饮水, 第11 d处死动物, 分离胃壁细胞.
1.2.3 大鼠胃壁细胞的分离与纯化: 在本室以往基础上加以改进[6]: 大鼠脱颈椎处死, 剖腹取胃, 结扎贲门和幽门. 在胃底部做一小切口, 用玻璃棒将胃袋翻转, 然后在胃底与胃体之间结扎, 弃去胃底, 用生理盐水将胃袋冲洗干净. 把预先配制好的链酶蛋白酶(Pronase)液约2.5 mL(1 g/L)注入胃袋. 然后将胃袋放入预先通氧的Medium A(MA)中, 在37 ℃水浴消化30 min后转入Medium B(MB)中, 用磁力搅拌器搅拌两次, 各10 min, 收集每次MB中打下的细胞悬液; 重新将胃袋放入新的MA中孵育20 min, 再用新的MB搅拌两次, 各10 min, 收集每次MB中打下的细胞悬液; 然后再次将胃袋放入新的MA中孵育10 min, 用MB 搅拌两次, 各10 min, 收集每次MB中打下的细胞悬液. 所有收集到的细胞悬液均用200目尼龙网过滤, 过滤液4 ℃、1 000 r/min、离心5 min, 倾出上清液, 沉淀用Medium C(MC)混悬以供纯化. 孵育过程皆充以950 mL/L O2+50 mL/L CO2. 取10 mL专用离心管, 用吸管在管底分别铺2 mL预先配制好的60%和40% Percoll液制成不连续密度梯度分离液, 将细胞悬液1 mL左右铺在最上层, 然后4 ℃、2 000 r /min、离心20 min进行纯化, 收集40%与60% Percoll交界面处的壁细胞, MC洗两次, 再用MC混悬备用.
1.2.4 胃泌素受体放射配基结合实验
1.2.4.1 益气健脾药物血清对脾虚大鼠离体壁细胞胃泌素受体结合容量的影响: 将正常大鼠纯化后的细胞悬液作为正常组, 脾虚大鼠纯化后的细胞悬液随机分为模型组、补中益气汤治疗组、党参治疗组及白术治疗组, 正常及脾虚组给予终浓度200 mL/L的空白血清, 补中益气汤治疗组、党参治疗组及白术治疗组分别给予等量的药物血清, 37 ℃作用20 min后, 用MC将细胞洗涤两次, 然后用白细胞记数板在倒置显微镜下将细胞浓度调整为1×109 cells/L, 供放射配基结合实验用. 操作规程及运算参照本室建立的常规方案稍加改进[7], 根据预试(多点饱和实验)确定125I-胃泌素放射配基的近饱和终浓度为100 pmol/L, 并以此为基础做单点结合实验, 加样顺序如下(表1).
| 125I-胃泌数 | MC | 非标记胃泌素 | 细胞悬液 | |
| 总结合管(TB) | 10 | 10 | - | 180 |
| 非特异性结合管(NSB) | 10 | - | 10 | 180 |
加样后37 ℃孵育30 min, 加冰冷的MC720 μL终止反应, 迅速用多头细胞收集器收集至玻璃纤维滤膜3次. 烘干滤膜后, 置于γ计数器测量放射性. 特异性结合(SB) = 总结合(TB)-非特异性结合(NSB). 以上均各做三个复管. 特异结合位点数由以下公式求出: 位点数(单个细胞)=(特异结合×6.022×1023)/(计数效率×2.2×106×放射比活度×放化纯度×109×细胞总数).
1.2.4.2 补中益气汤含药血清对大鼠离体壁细胞胃泌素受体结合的抑制作用: 根据预试确定胃泌素受体放射配基的饱和终浓度为100 pmol/L, 并以此为基础做单点结合实验, 非特异结合管加入1 000倍非标记胃泌素, 竞争结合测定管分别加入空白和补中益气汤含药血清(终浓度200 mL/L), 加样步骤如下(表2).
| 胃泌素 | MC | 竞争剂 | 细胞悬液 | |
| 总结合管(TB) | 10 | 10 | - | 180 |
| 非特异结合管(NSB) | ||||
| 或竞争结合测定管(TB0) | 10 | - | 10 | 180 |
加样后操作同上. 相对结合率 = (TB0-NSB)/(TB-NSB)×100%. 抑制率 = 1-相对结合率. 结果判断: 抑制率>30%, 有活性; 抑制率0-30%, 无活性[8].
统计学处理 采用统计软件SPSS11.0分析. 实验数据均以mean±MD表示, 用t检验处理, P<0.05为有统计学差异.
脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体结合容量明显低于正常大鼠(P<0.01), 补中益气汤治疗组结合位点数明显回升, 与脾虚组比较差异显著(P<0.05), 党参、白术药物治疗组结合位点数也有上升趋势, 但与脾虚组相比差异不显著(P>0.05, 表3).
胃泌素是一种重要的内分泌激素, 既可刺激胃黏膜细胞的增生, 维持胃黏膜的完整性; 又能作为胃酸分泌的主要刺激因子而刺激酸分泌, 胃泌素与其受体的正常结合和受体的良好介导是壁细胞泌酸功能得以正常发挥的前提和保证[9-10]. 本研究及以往整体实验一致揭示[11]: 脾虚大鼠胃泌素受体结合容量明显低于正常大鼠. 脾虚状态下单纯的胃泌素受体结合容量的减少会导致受体后的信号减弱而引起酸分泌功能低下(下调), 这与我室前期的研究结果-脾虚大鼠基础泌酸功能低下相吻合. 而我们以往的研究还表明脾虚状态下壁细胞胃泌素受体亲和力增加[11], 提示壁细胞胃泌素刺激酸分泌通路在受体这个环节可能产生了敏感性增强而使其减弱的功能出现了代偿(上调), 这又为我们对脾虚证研究得出的"基础状态酸分泌低下, 受刺激后亢进"的结论(文章待发表)提供了受体水平上的依据, 壁细胞分泌的胃酸在病理情况下又可作为攻击因子而与溃疡病的产生关系密切, 因此我们推测脾虚大鼠胃泌素受体结合容量及亲和力的改变有可能是我们临床上观察到的脾虚证患者易患消化性溃疡性疾病及实验性脾虚大鼠胃黏膜易损性增高在受体水平上的病理机制之一, 胃泌素受体的异常介导可能参与了脾虚证的病理形成过程.
血清药理学方法是由日本学者田代真一首先创建和命名的, 由于他克服了整体实验影响因素多, 用药时间长等缺点, 同时又避免了直接加药非有效成分的干扰, 因此该方法一经建立便迅速得到了医药界的广泛应用[12-13]. 但此方法应用于壁细胞也应注意以下几点: 首先在制备含药血清时, 从动物体内取出的血清要在常温(15-25 ℃)下放置至少2 h以使血液充分凝固方可离心吸取上层血清, 否则制备的将是含药血浆而不是含药血清, 血清药理学也就变成了血浆药理学了; 在细胞的制备阶段应在提高纯度的基础上尽量保持细胞的活性, 因此我们分离细胞时采用了消化-搅拌-再消化、即消化与搅拌交替的方法, 以免使细胞处于无钙的环境(消化阶段)过久, 丧失活性而影响细胞功能, 最终导致细胞对药物的敏感性下降; 另外, 药物与细胞作用期间温度应尽量保持与生理条件下相一致以使细胞对药物的反应更接近于机体状态.
我们所采用的方药中, 补中益气汤是临床常用的益气健脾经典名方; 党参和白术既是该方中的主要组成药物, 也是临床常用的益气健脾中药. 该实验结果显示脾虚大鼠壁细胞经补中益气汤作用后结合位点数显著回升, 党参、白术作用后也有上升趋势. 其中补中益气汤的作用明显大于党参和白术, 体现了复方配伍的整体优势; 我们还发现: 补中益气汤含药血清体外给药能明显抑制大鼠壁细胞胃泌素受体放射配基的特异性结合, 其特异性结合抑制率除去空白血清的影响外, 可达42.9%, 提示补中益气汤通过调节胃泌素受体, 使脾虚证复健的原因可能与胃泌素受体竞争性结合有关, 其确切机制我们将进一步深入研究.
编辑:N/A
| 2. | Sachs G. Physiology of the parietal cell and therapeutic implications. Pharmacotherapy. 2003;23:68-73. [DOI] |
| 3. | 张 根水, 王 汝俊. 脾虚大鼠胃壁细胞胃泌素受体研究及黄芪作用观察. 中国中医基础医学杂志. 2002;8:44-45. |
| 8. | 隅 田利彦, 杉 木广之, 不 破亨, 山 崎和男, 武 田理, 神 田博史, 仲 田义启, 濑 川富朗, 周 俊. Receptor Binding Assay法を用ぃに药用植物中の活性成分の研究. 药学杂志. 1998;108:450-453. |
| 10. | Yao X, Forte JG. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annu Rev Physiol. 2003;65:103-131. [PubMed] [DOI] |