0 引言
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP), 特别是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)病情凶险, 死亡率高. 过度活化的炎性细胞及其炎症因子决定了AP的临床进程. 这些炎性递质进入血液循环后可激活机体其他炎症细胞释放大量炎性递质, 引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 而SIRS是AP发生MODS的必由之路. 虽然SIRS缺乏显著的临床特征, 但其在AP的疾病发展过程中的作用却越来越受到关注; 进一步研究发现TNF-α、IL-1、CAM1等多种细胞因子及黏附分子在基因水平上受到核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的调节[1-2]. AP发生时NF-κB在其发病的早期即被激活, 从而诱导细胞因子、趋化因子、氧自由基、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等表达, 促进局部的炎症病变向全身多系统多脏器发展[3]. 本文着重从NF-κB与炎症反应、胰外脏器损伤及网络调节的关系出发, 就NF-κB在AP时与SIRS发生的关系综以论述.
1 NF-κB的结构及生物学特征
1.1 NF-κB的结构
NF-κB是由NF-κB/Rel蛋白家族成员, 包括RelA(P65)、RelB、cRel、NF-κB1(P50/P105)和NF-κB2(P52/P100)组成的同源或异源二聚体[4]. 这些蛋白的N端均有一个约300个氨基酸的Rel同源区(Rel homology domain, RHD), 内含DNA结合区、二聚体化区及核定位信号(NLS), 分别具有与DNAκB序列结合、形成二聚体及与NF-κB抑制蛋白(IκB)相互作用等功能. Rel蛋白因结构、功能等方面的不同, 可分为二类[5]: 一类是RelA(P65)、RelB及cRel, 其C端含反式激活区(transactivating domain), 具有激活基因转录的功能; 另一类是NF-κB1(P50/P105)和NF-κB2(P52/P100), 其C端含锚蛋白重复区(ankin repeat domain), 缺乏转录激活区, 无独立激活基因转录的功能. NF-κB/Rel蛋白间可形成多种二聚体, 如P50/RelA、P52/RelA、Rela/cRel、P50/P50、P52/P52、及RelA/RelA, 其中发挥主要功能的是P50/RelA异源二聚体, 他几乎存在于体内所有细胞. 通常说的NF-κB一般即指P50/RelA.
1.2 NF-κB的生物学特征
在静息状态时, NF-κB通常与其抑制物IκB结合形成三聚体以无活性的复合体而被"囚禁"在细胞质中(P50/P50不受IκB的囚禁), 当细胞受到胞外信号刺激时, 通过一个或多个信号转导途径激活一系列激酶, 使IκB两个保守的N端丝氨酸残基磷酸化, 随后赖氨酸残基发生泛素化, 最后在26S蛋白酶体的作用下, IκB降解, 使NF-κB与IκB发生解离, 并迅速从胞质易位至胞核, 在胞核内与相应基因上的κB位点发生特异性的结合, 调控细胞因子、化学趋化因子、细胞黏附分子、iNOS和协同刺激分子等相关基因的表达. 目前认为NF-κB可能选择性地与某些κB位点结合并产生反式激活作用, 从而促进某一类型的细胞因子产生. 不同的二聚体与不同的DNA序列结合, 且亲和力和转录激活能力是不一样的, 如P50/RelA与κB序列5'GGGRNNYYCC3'的亲和力高; RelA/cRel与κB序列5'HGGARNYYCC3'的亲和力高(R代表嘌呤, Y为嘧啶, N为任意碱基, H为碱基A, C或T).
2 NF-κB的活化及调节
2.1 NF-κB的活化
目前已发现多种因素可以诱导NF-κB的活化[6], 包括肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、脂多糖(LPS)、氧化剂、放射线、紫外线、病毒及其代谢产物、抗原受体交联、钙离子载体、蛋白激酶(PKC)、抗原、植物凝集素(PHA)、刀豆素(CONA)和佛波醇(PMA)等与细胞分裂、增生有关的因素也可促进NF-κB的活化. 其激活机制是一个复杂的过程, 尚未完全阐明, 但至少需要两个步骤: (1)IκB从NF-κB复合体上解离降解, 暴露NF-κB的核定位序列; (2)NF-κB发生核易位并与特定的DNA序列结合, 其中IκB的蛋白磷酸化和蛋白水解是两个主要环节. 各种刺激信号(如TNF-α、IL-1等)通过细胞膜上的受体或配体将信号传至胞质, 通过NF-κB的诱导酶(NIK)的磷酸化, 激活IκB激酶复合体(IKK), 使IκB蛋白上的Ser32和Ser36磷酸化, 基于26S蛋白酶体的IκB成员随之被降解, NF-κB与IκB解离后迅速从胞质易位至细胞核, 与调控细胞因子表达的基因启动子或增强子上的特异性序列结合, 调节相关基因转录. H2O2通过氧化应激活化NF-κB的途径则例外, 他是通过磷酸化IκBα上的Tyr残基, 促使IκBα从NF-κB/Rel复合体中解离, 而不是使IκBα降解.
自科学家发现丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的上游激活酶raf-1(即mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPKKK)与NIK有一定的序列同源性和结构相似性, 二者属于同一家族成员; 并发现, TNF-α、IL-1等胞外刺激可通过不同的信号转导途径激活MAPKKK[7-8]. 许多学者认为MAPK在激活NF-κB中发挥重要作用. 人们用牛磺胆酸钠诱导AP模型鼠发现巨噬细胞MAPK活性增强, 同时伴有NF-κB的激活[9]. Chen et al[10]认为MAPK家族中的P38才是MAPK激活NF-κB过程中的主角, 而非其他成员(P44/P42MAPK). 因为他们发现用P38MAPK的抑制剂SB203580能明显抑制LPS对NF-κB的活化, 而P44/P42 MAPK抑制剂PD98095则无此作用. 但Murr et al[11]用弹性蛋白酶刺激Kuffer细胞, 在7 min时既可检测出磷酸化的P38-MAPK, SAPK/JNK和ERK1/2, 以及活化的NF-κB, 和TNF-α的表达; 在60 min时NF-κB和TNF-α回落, 而P38-MAPK, SAPK/JNK和ERK1/2仍处于活性状态. 抑制MAPK只能部分抑制NF-κB活性. 认为MAPKKK-MAPKK-MAPK级联反应并不完全会聚NF-κB, 但NF-κB在细胞因子瀑布效应中却发挥着开关(switching off)作用.
许多研究已证实感染、内毒素血症参与了AP的发病机制, 内毒素的结构成分LPS进入血液循环后与LPS结合蛋白(LPB)结合, 然后再结合细胞膜表面的受体CD14分子, LPS以LPS-LBP-CD14三体复合物形式活化Toll样受体4(TLR4)的信号传导, 其信号传导可以通过NF-κB激活细胞因子(如IL-1、IL-6和IL-8)基因转录[12]. Hietaranta et al[13]发现胰弹性蛋白酶可以促进人骨髓培养细胞(THP-1)TNF-α的产生, 其过程可以被NF-κB抑制剂和TLR4抗体抑制, 认为胰弹性蛋白酶是通过TLR4/NF-κB通路发挥其促炎作用. 血清中磷酯酶A2(PLA2)的催化活性与胰腺炎严重程度密切相关, 尤其当胰腺炎并发出血坏死时, 其活性升高最为显著. PLA2主要包括磷脂酰胆碱和溶血磷脂胆碱, 研究发现后者在多种细胞(如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核细胞等)中可活化NF-κB并诱导基因表达、编码各种黏附分子、细胞因子和生长因子. Masamune et al[14]用溶血磷脂胆碱处理AR42J细胞, 发现其浓度在大于或等于10 mmol/L时可诱导细胞发生凋亡, 在10和25 mmol/L时可提高NF-κB和活化蛋白-1(activating protein-1, AP-1)的DNA结合活性, 并促进NF-κB和AP-1调控的基因转录. 因而, 认为溶血磷脂胆碱通过诱导NF-κB的活化促进多种参与AP病理生理过程的物质的表达, 在炎症反应过程中起到重要作用, 其结果是大量促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、黏附分子、脂类递质和凝血因子的过度表达, 从而引起SIRS.
2.2 NF-κB的调节
体内NF-κB的活化调控包括两条途径: (1)经细胞外的正反馈途径. NF-κB活化后, 可增强TNF-α和IL-1β的基因转录, 使TNF-α和IL-1β产生和释放增多, 进而再次激活NF-κB, 使IL-6和IL-8产生和释放增多, 导致最初的炎症信号进一步放大; (2)经细胞内、外的负反馈途径. 细胞内NF-κB活化后, 在启动炎症递质基因转录的同时, IκBα和P105的基因转录亦被上调, 这是由于这两种基因的启动子均含有NF-κB反应元件, 这将有助于将NF-κB限制在细胞质, 下调细胞核中NF-κB的活性, 从而终止炎症递质的生成; 另外, NF-κB的活化, 也使同源二聚体生成增多. 此种二聚体易位于细胞核后, 虽然能与NF-κB竞争性地结合κB序列, 抑制NF-κB的活性, 但是由于该二聚体无转录激活区, 所以可减少炎症递质及黏附分子的表达. Hoffmann et al[15]研究NF-κB/IκB负反馈调节通路时, 发现IκBα, IκBβ和IκBε都具有抑制NF-κB的功能, 但NF-κB激活后仅上调IκBα的基因表达, 却不上调IκBβ和IκBε的基因表达, 这说明在NF-κB/IκB 负反馈调节通路上主要发挥作用的是IκBα. 细胞外也存在负反馈调节. 刺激NF-κB活化的因素如IL-1β、TNF-α也可导致反向调节细胞因子如IL-10、IL-13等的产生, 他们可抑制炎症细胞因子的产生. 这种作用是IL-10、IL-13通过阻断NF-κB活化而产生的.
3 NF-κB在急性胰腺炎全身炎症反应综合征中的作用
3.1 NF-κB与AP炎症反应的关系
SIRS发生和发展的病理生理基础在于过度失控的炎症反应. 已证明AP时伴有促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等)升高, 而且其升高幅度与AP的严重程度密切相关[16]. NF-κB作为一个重要的调控因子, 调节多种参与炎症反应相关基因的转录. 在AP发生、发展过程中, NF-κB的过度活化可引起多种炎症反应相关基因的表达上调, 导致炎症递质、细胞因子的大量产生. 许多动物实验及体内外细胞实验证实, AP时胰腺内NF-κB激活伴有过度活化的炎症细胞, 主要有中性粒细胞、单核/巨噬细胞、内皮细胞等, 他们可释放多种炎性递质, 如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、细胞间黏附分子(ICAM1)、血管细胞黏附分子 1(VCAM1)、氧自由基(ROS)、iNOS、血小板活化因子(PAF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、环氧化酶2(COX2)及P、E选择素等. 这些炎性递质基因上的启动子和增强子中都存在一个或多个κB序列即NF-κB的结合位点[17], 活化的NF-κB可单独或与其他转录因子协同参与上述炎症递质基因的诱导表达. Krappmann et al[18]进一步发现LPS可活化TLR4信号传导, 在B细胞前体和树状细胞通过IKK/NF-κB通路上调AP-1的表达, 他们认为AP-1是NF-κB的靶基因. Fujioka et al[19]也通过体外实验得出同样的结果. NF-κB和AP-1均是调节炎性递质产生和释放的重要转录因子, 共同参与SIRS的发生和发展, 其中LPS通过早期激活NF-κB和继发激活AP-1加重炎性反应, 进一步说明NF-κB在炎性递质调节网络中发挥主要作用.
Chen et al[3]采用腺病毒作为载体, 使目的基因(NF-κB活性亚单位ReLA/P65的基因)与腺病毒的DNA片段发生整合, 而后经胰管注射的方法直接将含有目的基因的腺病毒(Ad p65)注入胰腺, 发现注入Ad p65后, 大量胰腺细胞被感染, NF-κB目的基因在胰腺内表达、产生大量活化的NF-κB, 并伴有严重的炎症反应发生, 在胰腺内可以见到大量中性粒细胞浸润及广泛的组织病理损伤; 而整合了对照基因的腺病毒未见引起胰腺内NF-κB的表达、活化, 以及胰腺的组织病理损伤. Altavilla et al[20]用雨蛙素诱导NF-κB基因敲除鼠, 与同胎WT小鼠对照, 发现其TNF-α水平及血清淀粉酶水平下降, 为NF-κB活化与AP的炎症反应之间的相关性提供了直接的证据.
Grewal和Norman et al[21-22]研究发现, SAP时首先在胰腺内产生, 然后在肺肝内产生, Gukovsky et al[23]在胰腺炎的动物模型中发现, 建立模型后30 min NF-κB即有强烈的表达, 指出NF-κB的早期高表达在诱发AP的炎性反应中至关重要. Ethridgeet al[24]发现在3-6 h NF-κB表达又会出现第二个高峰, NF-κB的第一个高峰的出现是第二个高峰的出现的基础, 且由NF-κB调控的基因产物与NF-κB的激活相平行[25]. 提示NF-κB的两次激活与AP的SIRS密切相关. 我们是否可以认为NF-κB首先在胰腺激活, 释放细胞因子可以通过"扳机样作用"触发炎症递质的"瀑布样级联反应", 炎性递质释放入血. 胰内通过NF-κB的细胞内、外的负反馈途径抑制NF-κB的激活. 但炎性递质又可再度激活胰外脏器(中性粒细胞、Kuffer细胞、肝、肺、肠等)的NF-κB, 导致大量炎性递质产生, 从而引起SIRS.
3.2 NF-κB与胰外脏器损伤
AP相关肝、肺及肠黏膜的损伤为SIRS的发生提供了直接证据. 许多研究显示在肝、肺和肠黏膜都发现有NF-κB的激活[26-28], 其参与了SIRS的发生和发展, 而随后发生的ARDS和MODS成为胰腺炎的主要死亡原因. Masamune et al[29]将急性坏死性胰腺炎的腹水注入健康大鼠腹腔后, 引起大鼠肺内粒细胞NF-κB的激活, 提示SAP时, 腹水对远处器官的损害是通过NF-κB的激活及随后产生的细胞因子起作用的.
3.2.1 NF-κB与AP相关肺损伤: Pastor et al[30]认为急性肺损伤是AP的常见并发症, 并是AP早期死亡原因, 在SAP早期发生SIRS患者中50%死于相关肺损伤, 其发病机制不甚清楚, 但许多动物实验发现炎性细胞及炎性递质(TNF-α, IL-1β, ICAM-1, IL-10, PAF)参与了肺损伤的发生. Jaffray et al[31]发现弹性蛋白酶可激活NF-κB促进白细胞产生细胞因子, 从而引起类似胰腺炎相关ARDS的肺损伤. 进一步研究发现弹性蛋白酶可诱导肺IKKα, IKKβ的降解(30 min), NF-κB的激活(60 min)和TNF-α基因的表达(60 min), 并导致中性粒细胞的侵润(4 h)和肺泡毛细血管渗出(24 h). AP病程中, NF-κB激活后可启动iNOS基因转录, 使一氧化氮(NO)产生显著增加, NO不仅是一种舒血管因子, 也是一种较强的炎症递质, 他可发挥强烈的舒血管作用, 导致肺血管通透性增加, 同时大量产生的NO亦可以通过其细胞毒作用直接造成肺细胞损伤[32].
3.2.2 NF-κB与AP相关肝损伤: Murr et al[33]发现胰弹性蛋白酶可诱导远处器官巨嗜细胞产生TNF-α, 从而引起胰腺炎相关肝损伤, 其可能的机制是通过激活NF-κB作用于肝Kupffer细胞, 从而刺激细胞因子的产生. 研究表明SAP时肝组织产生细胞因子并介导肝损伤. 研究进一步证实, 正常肝组织内很少见NF-κB活化, AP肝组织内NF-κB活化, 活化的NF-κB主要位于肝细胞核内. 研究结果还表明, 给予NF-κB抑制剂吡咯啉烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)预处理后, 再制备SAP模型, 大鼠的谷草转氨酶(AST)明显降低, 说明抑制NF-κB活化可降低AST水平, 对肝损伤具有保护作用. Gray et al[34]构建表达photinus萤光素酶的转基因鼠模型, 该酶受到依赖于NF-κB启动子的调控, 可以间接反映NF-κB的活性, 用缺乏胆碱而辅加乙硫氨酸(CDE)饮食诱导转基因鼠AP后, 测定活体和胰、肝、肺组织匀浆的萤光素酶活性, 结果发现在CDE饮食48 h和60 h后活体动物上腹部萤光素酶活性明显升高, 60 h和72 h可观察到胸腔萤光素酶活性明显升高; 胰、肝、肺组织匀浆的萤光素酶活性在48 h和60 h后均明显升高, 支气管肺泡灌洗液中总的有核细胞数在72 h明显增多, 表明肝脏通过激活NF-κB活性在AP的SIRS中发挥重要作用. Folch-Puy et al[35]用胰腺相关蛋白(PAP)腔静脉注射诱导大鼠胰腺炎肺损伤, 对照牛磺胆酸钠诱导大鼠胰腺炎, 3 h后检测肝肺的TNF-α、P-选择素、热休克蛋白(HSP-70)的mRNA表达和细胞外超氧化锰歧酶(EC-SOD)水平. 发现肺内P-选择素高表达, 坏死渗出、氧化反应明显. 血清TNF-α水平增高, TNF-α mRNA在肝过度表达伴随NF-κB的激活, 原位杂交显示TNF-α过度表达定位于肝细胞. 由PAP诱导的肺损伤能被抗TNF-α抗体抑制, 表明PAP对胰腺炎的肺损伤是通过激活肝细胞TNF-α的表达和TNF-α释放入血液循环后作用于肺, 激活机体其他炎症细胞释放而形成的.
3.2.3 NF-κB与AP相关肠黏膜损伤: SIRS的发生与感染密切相关, 虽然AP感染不是产生SIRS的首发因素, 但对SIRS的发展却起着推波助澜的作用, AP患者SIRS伴有感染者的死亡率高于不伴感染者. Kazantsev et al[36]曾在16条犬中利用标记pUC4K质粒的大肠杆菌研究坏死型胰腺炎时细菌的移位及感染源, 提出肠道是胰腺感染的发源地, 且AP时肠黏膜的缺血性损伤将促进细菌移位的发生. Ogawa[37]认为SAP时可继发肠道屏障功能衰竭, 肠腔内细菌及毒素易位至胰腺和其他脏器, 导致细菌感染移位, 造成第二次打击, 并进一步激发SIRS的发生. 研究表明, 用牛磺胆酸钠诱导的急性坏死型SD大鼠模型NF-κB于3 h即大量激活, 主要位于肠绒毛上皮的细胞核靠近肠绒毛顶端的单核细胞, 并介导炎症反应[28]. NF-κB一方面加重肠道屏障功能衰竭, 另一方面则促使SIRS不断扩大.
3.3 NF-κB的网络调节
目前AP的确切发病机制仍未完全阐明, 自身消化学说、细菌移位和继发感染-第二次打击学说、微循环障碍学说、白细胞过度激活学说、细胞因子和炎症递质学说以及免疫机制、细胞凋亡和氧自由基学说等均在某个侧面对AP的发病机制进行了阐述, 而各学说都承认NF-κB具有细胞信号传导的作用. NF-κB作为一种转录因子是影响细胞因子产生的重要调节剂. 在体内, NF-κB的活化过程受到精细调控. Kunsch et al[38]发现, 不同的κB位点与不同的NF-κB间具有不同的亲和力. Lin et al[39]证实, 不同的NF-κB与同一κB位点结合后激活转录的能力也不同. Yeger-Lotem et al[40]认为蛋白间的作用(protein-protein interaction, PPIs)和基因转录调节(transcription-regulation interaction, TRI)是细胞内网络修饰的两大方式, NF-κB的激活物通过PPIs构成的网络, 而NF-κB通过TRI又可再次作用于其激活物, 构成一个更庞大的网络, 而NF-κB就处于转录调节环节上, 发挥重要作用.
总之, 细胞因子网络的失衡在AP的发生占有极其重要的地位, ARDS、MODS与细胞因子等炎性递质的高表达之间存在明显的关系. NF-κB可在转录水平上调控这些炎症递质的基因表达, 并在细胞因子瀑布样级联反应中起着中心作用. 一项前瞻性的临床研究结合体外实验也表明, 外周血单核细胞NF-κB激活的患者, 其并发症的风险显著提高, 并与NF-κB的激活程度相关[41]. 从理论上讲, 如果能有效拮抗NF-κB的活化, 则可起到以一当十, 事半功倍的抗炎效果. 因此将NF-κB作为研究AP发病机制及调节器官功能的方向, 选用特异性的NF-κB抑制剂, 截断NF-κB激活的信号转导途径从而拮抗SIRS的发生发展, 有可能成为今后治疗AP的重要手段之一[42].
