乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化

摘要

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)全S反式激活新型靶基因, 进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制.

方法: 以HBV全S蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 提取mRNA逆转录为cDNA, 经RsaI酶切后将实验组cDNA分成2组, 分别与2种不同的接头衔接, 与对照组cDNA进行二次杂交和二次PCR. 并结合生物信息学技术, 克隆HBV全S反式激活作用的新型靶基因.

结果: 对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段. 成功克隆出他的全长序列并测序证实, 其可以被全S蛋白反式激活, 故命名为全S反式激活蛋白1(CSTP1), 已在GenBank中注册, 注册号: AY553877. CSTP1基因的编码序列全长为945个核苷酸(nt), 编码产物由315个氨基酸残基(aa)组成.

结论: HBV全S蛋白具有反式激活蛋白1基因克隆成功. HBV全S反式激活新靶基因的发现, 为进一步研究HBV全S的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

关键词: N/A

Cloning of human gene 1 transactivated by complete surface protein of hepatitis B virus

Gui-Qin Bai, Jun Cheng, Yan Liu, Shun-Hua Wu, Shu-Mei Lin, Yan-Ping Huang, Shu-Lin Zhang

Gui-Qin Bai, Jun Cheng, Yan Liu, Shun-Hua Wu, Shu-Mei Lin, Yan-Ping Huang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China

Shu-Lin Zhang, Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, Shaanxi Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. C03011402, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of Chinese PLA

Correspondence to: Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuan Zhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn

Received: May 28, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: November 15, 2004

Abstract

AIM: To screen and clone the target genes transactivated by complete surface protein of hepatitis B virus (HBV) and to pave the way for further elucidating the pathogenesis of HBV infection.

METHODS: The mRNA was extracted from HepG2 cells, transfected with pcDNA3.1(-)-complete surface and pcDNA3.1(-) empty vector respectively, to synthesize cDNA. After digested by RsaI, the cDNA was divided into two groups and connected to different sites, and then suppression subtractive hybridization (SSH) method and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were employed to analyze the differentially expressed DNA sequence between the two groups. The coding gene transactivated by HBV complete surface was cloned by bioinformatics methods. The obtained sequences were searched for homologous DNA sequences from GenBank.

RESULTS: One of the obtained sequences had no homology with known genes in GenBank and its fuction was unknown. It could be transactivated by complete surface protein of hepatitis B virus, so it was named complete surface transactivated protein 1 (CSTP1). It was also registered in GenBank with the number AY553877. CSTP1 gene had 945 nucleotides and its coding product was made up of amino acid residues.

CONCLUSION: The human gene transactivated by HBV complete surface is successfully cloned. This result will pave the way for the study of the molecular mechanism of the transactivating effects of HBV complete surface protein.

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)为带包膜的肝DNA病毒属, HBV基因组中界定了4个开放读码框(ORF), 分别命名为S、C、P、X去, 其中S区又因不同的起始密码子(ATG)而又人为的分为前-S1、前-S2和S三个区[1]. 董菁et al[2]应用长距离并且精确PCR技术(long and accurate PCR, LA-PCR)研究了乙型肝炎患者血清中存在的HBV病毒基因组发现在前-S1的ORF之前存在一融合编码的ORF, 该区长135 bp, 命名为前-前-S区, 并且证实了在前-前-S基因上游277 bp核苷酸序列有启动子活性[3], 其功能为调控前-前-S区与HBV大蛋白的融合表达, 并提示前-前-S区的HBV克隆株多来自日本和中国[4]. 抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术, 具有实验周期短、易操作、可靠性高、假阳性率低等特点, 能有效地分离扩增低丰度特异表达的基因, 可以在较短的时间内获得较理想的实验结果[5-6]. 我们利用SSH对HBV全S(包括前-前-S区)蛋白反式激活作用进行研究, 将真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBV全S基因转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 并以转染空白载体的相同细胞系作为对照, 以2种转染的细胞系中提取的mRNA为起始材料, 应用SSH方法成功地构建了HCV全S蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库. 同时我们结合生物信息学(bioinformatics)技术克隆了全S蛋白反式激活的新型靶基因, 即HBV全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)基因, 从而为HBV全S蛋白作用的研究提供新的方向.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌DH5α为本室保存, pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司; FuGENE6 转染试剂购自Roche, mRNA Purification试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech, PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒购自Clontech, High Pure PCR Product Purification试剂盒购自Boehringer Mannheim公司, T7、SP6通用引物及pGEM-T载体、pGEM-Teasy载体购自Promega公司. HBV全S蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)- 全S由本室构建. DNA序列测定由上海博亚公司完成.

1.2 方法

消减杂交文库的建立及克隆分析: 分别将pcDNA3.1(-)-全S及pcDNA3.1(-)空载体转染HepG2细胞, 48 h后提取mRNA, 以此mRNA为模板逆转录合成双链cDNA(dscDNA), 并分别标记为Tester和Driver, 经RsaⅠ(一种识别4碱基序列的内切酶)消化后将Tester cDNA分为两份, 分别连接特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2, 与过量的Driver cDNA进行2次消减杂交和2次抑制性PCR, 使Tester cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增. 扩增产物与pGEM-Teasy载体连接, 转化DH5α感受态细菌, 平铺于含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37 ℃培养18 h. 挑取白色菌落, 增菌, 以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增, 证明含有插入片段后(200-1 000 bp), 测序. 根据电子拼接的新基因序列(945 bp), 利用生物信息分析软件Vector NTI设计新基因的序列特异性的含有特异性核酸内切酶(Eco R I/Bam HI)的引物, 利用HepG2细胞来源的mRNA, 经过RT-PCR扩增, 并与pGEM-T载体连接, 转化DH5α感受态细菌, 铺于含有氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37 ℃培养18 h. 挑取阳性菌落, 增菌, 使用碱裂解法提取质粒后进行双酶切(Eco RI/Bam HI)和菌落PCR鉴定, 证明目的基因约945 bp后测序, 进一步鉴定正确后获得阳性克隆.

2 结果

纯化高质量的mRNA是获得 cDNA高产量的前提. 紫外分光检测显示, 转染了全S表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA分别为4.94 μg和4.75 μg, A260/A 280 = 2.09. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳见 mRNA为大于0.5 kb清晰慧尾片状条带, 证实mRNA质优量足.

2.1 消减杂交文库的构建与分析

dscDNA两端连接效率检测结果显示两组dscDNA已与接头高效率连接. 消减效率的鉴定结果显示: 与未消减组PCR产物相比, 消减组PCR产物中看家基因甘油三磷酸脱氢酶(G3PDH)基因产物大大减少, 说明所构建的消减文库具有很高的消减效率. 对差异表达基因片段进行菌落PCR扩增, 结果显示为200-1 000 bp大小不等的插入片段. 挑选克隆测序并与GenBank数据库进行初步比较.

2.2 新基因的序列分析及全长基因的获得

利用美国国立卫生院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库(GenBank)及其同源基因序列的搜索(BLASTN), 发现其中的1个克隆序列与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源. 电子拼接推定该基因的开放读码框架, 设计引物, 从HepG2细胞提取总RNA后, 进行RT-PCR, 扩增出约945 bp片段(图1), 经过测序克隆出全长基因片段, 获得HBV全长S反式激活作用的新型靶基因, 命名为CSTP1. 新基因的开放读码框架(ORF)长度为945 nt, 编码产物由315 aa组成(图2).

图1 HBV全S蛋白反式激活靶基因CSTP1的RT-PCR扩增结果.

图2 HBV全S蛋白反式激活靶基因CSTP1的核苷酸序列和蛋白质一级结构序列.

3 讨论

病毒的基因表达调节与真核细胞相似, 主要是转录水平为主的多水平的调节机制, 转录水平的调节根据调节的机制和参与的因素不同, 可以分成顺式(cis)调节和反式(trans)调节2种. HBV基因组编码的蛋白作为反式激活因子, 对肝细胞某些基因表达调控的影响, 可能是HBV促进肝细胞恶性化和慢性化的主要因素. 早期研究多集中在整合的病毒DNA编码的HBxAg蛋白广泛的反式激活活性上[7-10]. 近年研究发现, 从肝癌细胞系或肝癌组织中亚克隆出的截短型前-S2/S基因表达产物羧基末端的截短型分子MHBst也具有反式激活功能[11-14].

乙型肝炎病毒感染, 不仅引起急、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关[15-16]. HBV为包膜DNA病毒, 他的包膜由3个相关的表面蛋白组成, 他们是主蛋白(S), 中蛋白(M, 前-S2+S), 大蛋白(L, 前-S1+前-S2+S). 还有前-前-S区, 由病毒基因组同一开放读码框编码, 但起始位点不同. 那么, 包括前-前-S在内的全S蛋白的功能如何呢？ 我们应用SSH研究包括前-前-S在内的全S蛋白的反式激活作用, 发现其反式激活的新基因CSTP1并对其进行克隆化研究, 将进一步完善全S的生物学功能. 并且, 对HBV感染的检测、疫苗设计、HBV进入肝细胞机制(受体学说)、表面抗原的表达过程及功能、宿主抗感染机制、HCC产生机制研究产生重大影响.

备注

编辑:N/A

参考文献

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