研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-10-15; 12(10): 2491-2494
在线出版日期: 2004-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i10.2491
b2-微球蛋白对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用
高学松, 成军, 甄真, 杨艳杰, 黄燕萍, 郭江, 刘妍, 戴久增
高学松, 成军, 杨艳杰, 黄燕萍, 郭江, 刘妍, 戴久增, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
甄真, 河北医科大学第三医院感染科 河北省石家庄市 050051
基金项目: 军队九五科技攻关项目, No. 98D063; 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No.C30070689; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队十五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队十五科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-07-28
修回日期: 2004-08-29
接受日期: 2004-09-30
在线出版日期: 2004-10-15

目的: 研究b2-m 对核心启动子表达的调节作用.

方法: 根据HBV核心启动子及b2-微球蛋白的序列设计引物, 用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和b2-微球蛋白基因, 分别构建HBV核心启动子的报告载体及b2-微球蛋白的真核表达载体, 脂质体法瞬时转染HepG2细胞.

结果: 成功构建HBV核心启动子的报告载体及b2-微球蛋白(b2-m)的真核表达载体. 脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后, 核心启动子在b2-微球蛋白(b2-m)的影响下, 其启动子活性降底2倍.

结论: b2-微球蛋白(b2-m)明显HBV核心启动子的表达.

关键词: N/A
引文著录: 高学松, 成军, 甄真, 杨艳杰, 黄燕萍, 郭江, 刘妍, 戴久增. b2-微球蛋白对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(10): 2491-2494
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: July 28, 2004
Revised: August 29, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: October 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 前言

乙型肝炎病毒(HBV)的感染不仅引起急、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生密切相关. 但HBV DNA复制的分子生物学机制仍不十分清楚. 为了寻找肝细胞中可能具有调节作用的蛋白, 前期研究中我们利用噬菌体表面展示技术, 以HBV核心启动子DNA为固相支持分子, 筛选人肝细胞cDNA文库, 获得了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白-b2-微球蛋白(b2-m), 为深入研究其和HBV核心启动子结合的机制及功能, 我们分别构建了报告载体和真核表达载体, 共转染细胞, 阐明二者之间的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

质粒pGEM-Teasy和pcDNA3.1(-)(Promega公司), Taq酶、琼脂糖、dNTP、T4 DNA连接酶、RNA酶、玻璃奶DNA回收试剂盒(博大科技), CAT ELISA试剂盒(Roche), EcoR V、BamH I、Mlu I、Nhe I(购置宝生物公司), 热循环仪、凝胶成像仪、酶联免疫吸附读数仪、大肠杆菌DH5a、pCP10质粒为本实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 HBV核心启动子的扩增和克隆: 根据HBV ayw的基因序列设计引物, 在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡核苷酸引物, P1: 5'-ACG CGT CCA AGG TCT TAC ATA AG-3', P2: 5'-GCT AGC ATG ATT AGG CAG AGG TG-3'片段大小为251 bp. 在引物5'端分别引入Mlu I和Nhe I位点, 由上海生工公司合成.

1.2.2 b2-微球蛋白的扩增和克隆: 根据b2-微球蛋白基因序列设计引物. P3: 5'-GAT ATC ATG TCT CGC TCC GTG GCC TTA G- 3', P4: 5'-GGA TCC TTA CAT GTC TCG ATC CCA-3'在5'-端分别引入EcoR V、BamH I酶切位点. 引物由上海生工公司合成.

1.2.3 重组报告载体pCAT-CP 的构建与鉴定: 将HBV核心启动子PCR纯化产物与pGEM-Teasy载体混合在16 ℃条件下用T4 DNA连接酶连接过夜, 随后转化用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5a感受态, 在铺有IPTG/X-gal 的氨苄西林(LB/Amp)平板上进行蓝白斑菌落筛选, 挑取白色菌落采用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定. 此质粒及pCAT Basic 均用Mlu 和Nhe 双酶切回收相应的酶切片段在16 ℃条件下用T4 DNA 连接酶连接过夜随后转化用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5a感受态, 随机挑选在LB/Amp 平板上生长的菌落, 采用碱裂解法提取质粒, 进行Mlu I和Nhe I 双酶切鉴定.

1.2.4 重组表达载体pcDNA3.1(-)-b2-m 的构建与鉴定: 将噬斑的PCR 纯化产物与pGEM-Teasy载体混合在16 ℃条件下用T4 DNA 连接酶连接过夜, 随后转化大肠杆菌DH5a感受态, 在铺有IPTG/X-gal 的氨苄西林平板上进行蓝白斑菌落筛选, 挑取白色菌落用碱裂解法提取质粒, 进行酶切鉴定. 此质粒及载体pcDNA3.1(-)均用EcoR V和BamH 双酶切回收相应的酶切片段在16 条件下用T4 DNA连接酶连接过夜随后转化用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞随机挑选在LB/Amp平板上生长的菌落碱裂解法提取质粒, 进行EcoR V和BamH I 双酶切鉴定.

1.2.5 转染细胞: 分别用磁珠法提取质粒, 将pCAT-basic、pCAT- promoter、 pCAT-CP和pCAT-CP+ pcDNA3.1(-)-b2-m通过脂质体瞬时共转染HepG2细胞, 用ELISA 法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达, 研究pcDNA3.1(-)-b2-M 对 pCAT-CP 功能的影响.

2 结果
2.1 pCAT-CP重组质粒的酶切鉴定

利用自行设计的引物P1/P2 成功扩增出HBV 核心启动子基因片段, PCR产物经1 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段为206 bp, 与预期大小符合且无非特异扩增现象(图2). 用双酶切所得片段连接到用相同的Mlu I和Nhe I所切的pCAT 中经酶切鉴定结果正确. 表明pCAT-CP质粒构建成功(图1).

图1
图1 pCAT-CP 重组质粒酶切鉴定. Lane M: 15 000 DNA Ladder;Lane 1: pCAT-CP Mlu /Nhe cut.
图2
图2 HBV核心启动子扩增片段 Lane M: 2000 DNA Ladder; Lane 1: HBV core promoter PCR.
2.2 pcDNA3.1(-)-b2-m 重组质粒的酶切鉴定

利用自行设计的引物P3/P4成功扩增出b2-微球蛋白基因片段, PCR产物经1 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段为360 bp, 与预期大小符合且无非特异扩增现象(图3). 用双酶切所得片段连接到用相同的EcoR V和BamH I所切的 pcDNA3.1(-)中经酶切鉴定结果正确.表明pcDNA3.1(-)-b2-m 质粒构建成功(图4).

图3
图3 b2-微球蛋白扩增片段. Lane M: 2000 DNA Ladder; Lane 1: b2-microglobulin PCR.
图4
图4 pcDNA3. 1(-)-b2-m重组质粒的酶切鉴定. Lane M: 2000 DNA Ladder; Lane 1: pcDNA3.1(-)-b2-m EcoR V/BamH I cut.
2.3 pcDNA3.1(-)-b2-m 对pCAT-CP的激活作用

用脂质体法瞬时转染HepG2 细胞, 质粒用量1 mg, 脂质体用量3 mL. 培养48 h后进行ELISA 检测. 氯霉素乙酰转移酶(CAT)的OD值(见表1, 图5).

表1 重组载体共转染HepG2 细胞氯霉素乙酰转移酶检测结果.
分组质粒A值
1pCAT-basic0.021
2pCAT-promoter0.343
3pCAT-CP3.151
4pCAT-CP-pcDNA3．1(-)-β2m1.524
图5
图5 CAT-ELISA检测结果.
3 讨论

乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害人类健康的致病因子. HBV属嗜肝DNA病毒, 其基因组为3.2 kb部分双链的环状DNA. 目前已确定有四个主要的开放阅读框架, 分别负责编码核心抗原(pre-C/C)、核酸聚合酶(P)、表面抗原(preS/S)和X蛋白(X). 这些基因的表达受到顺式元件-启动子和增强子的调控. 目前在HBV基因组已发现并鉴定的顺式元件有四个启动子(C、X、SPⅠ、SPⅡ)、两个增强子(EnhⅠ和EnhⅡ)和糖皮质激素应答元件. 核心启动子产生两个3.5 kb RNA: 前- 核心和前基因组RNA. 前- 核心RNA编码前核心蛋白和e 抗原前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心和聚合酶蛋白而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳作为模板逆转录. 前基因组RNA 的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用. 核心启动子分为两部分: 基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS)其上游为负性调节元件(NER 1 616-1 621 nt) CURS 能激活邻近下游的BCP[1-8].

我们利用噬菌体展示技术以DNA为固相分子筛选肝细胞文库研究启动子结合蛋白. 获得了与HBV 核心启动子结合的蛋白[1]. 经同源性比较确定该蛋白与b2-微球蛋白(b2-m)同源, 同源性为95%.

人b2微球蛋白基因(b2 -microglobulin, b2-m)位于染色体15q21-22.2, 成熟蛋白产物由99个氨基酸组成的单链多肽低分子蛋白, 分子量为11.8 ku, 电泳在b2区, 故称b2微球蛋白. b2微球蛋白起源于人体间质, 上皮细胞和造血系统的正常细胞以及恶性肿瘤细胞均能合成, 细胞合成的b2微球蛋白是人类组织相容性抗原的一部分, 存在于细胞膜. b2微球蛋白与免疫球蛋白有结构同源性, 特别是IgG分子的CH3区. 在大多数类型细胞的细胞膜上都可以检测到b2微球蛋白[9-23]. b2微球蛋白与病毒性肝炎关系密切.其作为HLA-I复合体的一部分, 与肝细胞表面病毒抗原递呈有关, 在对病毒感染的免疫应答中起重要作用[24-25], Akdogan et al[26]研究发现使用a干扰素治疗转氨酶反复波动的慢性乙型肝炎患者, b2微球蛋白水平高者有较高应答的趋势, 治疗前后的水平有助与预测预后.而LApinski et al[27]在研究HCV感染患者在使用a干扰素治疗期间, b2微球蛋白与CD4淋巴细胞之间关系时发现b2微球蛋白显著升高是预后不良的指标, 开始治疗时CD4淋巴细胞数量增加预示治疗效果好. b2微球蛋白. 丙型肝炎患者血清b2微球蛋白水平高于健康对照组, 与疾病的病程与严重程度有关. 而且, 血清b2微球蛋白水平与HCV RNA水平显著相关, 与HCV基因型无关[28]. 在HCV感染相关的肝癌患者中, 血清b2微球蛋白水平升高反映肿瘤的大小, 似乎是免疫应答中体液因素(如IL-6)作用于肝细胞的结果. 免疫系统功能降低导致肝癌的进展和b2微球蛋白的过度表达[29].

总之, b2微球蛋白具有重要的免疫功能, 我们利用噬菌体展示技术筛选出与HBV 核心启动子结合的b2微球蛋白, 提示其与肝细胞和肝炎病毒相互作用, 在病毒性肝炎、肝硬化发生发展过程中起一定作用, 但是确切的分子生物学机制有待于进一步研究.

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