己酮可可碱对血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织Bcl-2, Bax表达的影响

摘要

目的: 观察己酮可可碱(pentoxifylline, PTX)对血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织中凋亡相关基因Bcl-2, Bax表达的影响.

方法: 建立小鼠血吸虫肝纤维化模型, 将小鼠随机分为4组: (1)感染对照组, (2)高剂量PTX治疗组(360 g/kg/d), (3)低剂量PTX治疗组(180 g/kg/d), (4)吡喹酮治疗组(500 g/kg/d). 观察4组小鼠治疗8 wk后肝组织中Bcl-2, Bax的表达水平, 同时观察肝组织的病理学变化.

结果: 高剂量PTX治疗组和吡喹酮治疗组肝组织变性坏死及纤维化程度均较感染对照组和低剂量PTX治疗组轻. 感染对照组、低剂量PTX治疗组、吡喹酮治疗组、高剂量PTX治疗组Bcl-2水平分别为(0.574±0.488%), (0.768±0.188%), (1.116±0.964%), (1.681±0.963%). 高剂量PTX治疗组Bcl-2水平明显高于感染对照组和低剂量PTX治疗组(P <0.05), 与吡喹酮组的表达水平相近(P >0.05). Bax水平分别为(0.372±0.291%), (0.351±0.249%), (0.465±0.356%), (0.79±0.642%). 4组间Bax的表达水平无显著差异(P >0.05).

结论: 高剂量PTX可能通过促进Bcl-2表达, 减少肝细胞的变性坏死, 阻断血吸虫肝纤维化的发生.

关键词: N/A

Effects of pentoxifylline on expressions of hepatic Bcl-2 and Bax protein in schistosomiasis mice with liver fibrosis

Ping Wei, Duan-De Luo, Li-Juan Xiong, Ling-Lan Zeng

Ping Wei, Duan-De Luo, Ling-Lan Zeng, Li-Juan Xiang, Dpartment of Infectious Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Supported by: the Science Research Foundation of Health Department of Hubei Province, No. 200019.

Correspondence to: Dr Duan-De Luo, Department of Infectious Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 1277 Jiefang Road, Wuhan 430022, Hubei Province, China. luoduande@hotmail.com

Received: June 16, 2004
Revised: July 9, 2004
Accepted: August 20, 2004
Published online: October 15, 2004

Abstract

AIM: To study the effects of pentoxifylline (PTX) on the expressions of hepatic Bcl-2 and Bax proteins in schistosomiasis mice with liver fibrosis

METHODS: The model of schistosomiasis liver fibrosis in mice was established. The mice were divided into 4 groups: control group, high dose PTX group (360 g/kg Per day, ×8 wk), low dose PTX group (180 g/kg Per day, ×8 wk) and praziquantel treatment group (500 g/kg Per day, ×2 d). Bcl-2 and Bax protein expressions were detected by immunohistochemisty. The pathological changes of liver were observed under microscope.

RESULTS: The levels of Bcl-2 expression in control group, high dose PTX group, low dose PTX group and praziquantel treatment group were (0.574±0.488%), (1.681±0.963%), (0.768±0.188%) and (1.116±0.964%) respectively. The level of Bcl-2 expression in liver tissues of schistosomiasis mice with liver fibrosis in high dose group was significantly higher than that in low dose group (P <0.05) and controls (P <0.05). The level of Bax expression showed significant difference among the four groups.

CONCLUSION: High doses of PTX could significantly increase expression of Bcl-2 in liver tissues of schistosomiasis mice with liver fibrosis by promoting Bcl-2 expression.

Key Words: N/A

0 引言

己酮可可碱(pentoxifylline PTX)具有抗肝纤维化的作用[1-5], 但其对血吸虫肝纤维化的防治少有报道. 而在我国近几年日本血吸虫病的发病率呈上升趋势, 特别是血吸虫病肝纤维化严重危害疫区人民的身体健康. 为探讨 PTX抗血吸虫病肝纤维化的作用机制, 我们建立了小鼠血吸虫肝纤维化模型, 给予PTX治疗, 并观察治疗前后凋亡相关基因Bcl-2, Bax在血吸虫肝纤维化小鼠肝组织中的表达情况, 旨在了解PTX对血吸虫肝纤维化肝组织凋亡的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

♂, Wistar小鼠, 4-6周龄, 40只, 体质量16-20 g, 购自同济医学院动物实验中心. 日本血吸虫尾蚴购自武汉市血吸虫病防治研究所. PTX采用石家庄制药集团有限公司第一制药厂生产的舒安灵片剂. Bcl-2, Bax试剂购自北京中山生物技术有限公司. 彩色病理图文报告分析系统, 型号HPIAS-1000为中国华海电子有限公司产品. 显微镜系日本0lympus (VANOX).

1.2 方法

将小鼠随机分为4组, 每组10只. (1)感染对照组: 每只小鼠人工感染日本血吸虫尾蚴25条, 感染后继续喂养10 wk, 不作治疗. (2)高剂量PTX治疗组: 感染后2 wk用高剂量PTX(舒安灵360 g/kg每日灌胃)治疗8 wk. (3)低剂量PTX治疗组: 感染2 wk后用低剂量PTX(舒安灵180 g/kg每日灌胃)治疗8 wk. (4)吡喹酮治疗组: 感染2 wk后用吡喹酮(500 g/kg每日灌胃)治疗2 d. 最后杀鼠取肝组织, 常规固定, 石蜡切片, 分别用HE染色和Masson法胶原纤维染色, 光镜观察肝组织病变, 根据文献[6]进行肝纤维化程度分期. 用免疫组化法测定肝组织Bcl-2和Bax的表达, 免疫组织化学SP法染色. 一抗为鼠抗人抗体, 二抗为羊抗鼠抗体, Bcl-2和Bax的工作滴度均为1:80, 每次实验均设磷酸盐缓冲液(空白对照)和正常兔血清取代一抗(阴性对照), 光镜观察Bcl-2和Bax的分布, 以细胞质膜或间质有棕黄色或深棕黄色颗粒为阳性. Bcl-2和Bax定量采用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统在低倍镜下计算他们在整个肝组织中的阳性面积[阳性目标总面积/统计场总面积(面密度)], 每张切片选取5个视野, 求平均值.

统计学处理 用SPSS 10.0软件统计, 计量资料用 mean±SD表示, 组间均数比较用t检验, 各组小鼠纤维增生程度的比较用秩和检验.

2 结果

2.1 肝组织病理学变化

感染对照组小鼠部分肝细胞变性, 有的呈灶性坏死. 汇管区见较多的虫卵肉芽肿, 其周围有嗜酸性粒细胞, 中性粒细胞和巨噬细胞浸润, 或有纤维组织增生, 有的纤维组织增生明显并向肝小叶周围伸延成干线型分布. 低剂量PTX组的病理变化与感染对照组相似. 高剂量PTX组和吡喹酮组的肝细胞变性坏死的程度及肝纤维化程度较前者明显减轻(P <0.05), 汇管区可见少量的虫卵肉芽肿和纤维增生, 肝小叶结构正常(表1).

表1 小鼠血吸虫肝纤维化程度的比较.

分组	n	肝纤维化分级
		S0	S1	S2	S3	S4
感染对照组	10	0	1	2	5	2
高剂量PTX组a	10	0	7	2	1	0
低剂量PTX组	10	0	1	2	6	1
吡喹酮组a	10	0	6	3	1	0

^aP <0.05 vs 感染对照组.

2.2 Bcl-2和Bax的表达

Bcl-2和Bax蛋白免疫组化染色呈棕黄色或深棕黄色. 在小鼠肝组织中分布广泛. Bcl-2主要表达在肝细胞质, 其次在肝细胞膜、肝窦等表达, 偶有汇管区表达(图1). Bax主要表达在肝细胞膜、肝窦, 呈线形(图2), 其次在肝细胞质表达, 偶有汇管区、虫卵结节中表达(图3). Bcl-2检测结果: 与感染对照组比较, 高剂量PTX组及吡喹酮组的表达水平明显增加(P <0.05), 低剂量PTX组差异不显著(P >0.05); 与吡喹酮组比较, 高剂量PTX组无显著差异(P >0.05), 低剂量组的表达水平明显下降(P <0.05); 高剂量PTX组与低剂量PTX组比较, 表达水平明显升高(P <0.05)(表2). Bax检测结果: 4组之间的表达水平无显著性差异(P >0.05).

图1 Bcl-2在肝细胞质中的表达(SP法, DAB显色×400).

表2 小鼠血吸虫肝纤维化肝组织Bcl-2, Bax的表达(mean±SD%,n = 10).

分组	Bcl-2	Bax
感染对照组	0.574±0.488	0.372±0.291
高剂量PTX组	1.681±0.963ae	0.790±0.642
低剂量PTX组	0.768±0.188c	0.351±0.249
吡喹酮组	1.116±0.964a	0.465±0.356

^aP <0.05 vs 感染对照组;

^cP <0.05 vs 吡喹酮组;

^eP <0.05 vs 低剂量PTX组.

图2 Bax在肝细胞膜、肝窦中的表达(SP法, DAB显色×400).

图3 Bax在虫卵结节中表达(SP法, DAB显色×400).

3 讨论

各种肝病肝组织中可有不同程度的肝细胞凋亡, 其强弱与病情的轻重有明显的相关性. Bcl-2是凋亡控制因子, Bax是凋亡促进因子. Bax为Bcl-2相关蛋白, 可与Bcl-2蛋白形成异二聚体并使之失活, 加强表达Bax形成同二聚体, 能加速细胞凋亡. 乙肝患者肝组织中, Bcl-2和Bax蛋白较正常对照组均有不同程度的增强, 且Bcl-2在增生区的表达显著高于各坏死区的表达. 各类坏死区及周围, Bax表达的阳性程度明显高于Bcl-2蛋白的表达[7]. 肝纤维化时大鼠肝组织Bcl-2和Bax表达加强[8]. PTX是甲基黄嘌呤theobromine的衍生物, 具有显著的抗肝纤维化作用[9], 其机制有控制肝星状细胞(HSC)转化为激活的肌样成纤维细胞(MFB);控制HSC和MFB增生; 减少胶原合成和分泌, 并可能促进其降解; 保护肝细胞等. 为探讨PTX抗血吸虫病肝纤维化的作用机制, 我们建立了小鼠血吸虫肝纤维化模型, 给予PTX治疗, 并观察治疗前后凋亡相关基因Bcl-2, Bax在血吸虫肝纤维化小鼠肝组织中的表达情况, 本结果表明, 用高剂量PTX防治小鼠血吸虫病肝纤维化, 能明显改善肝脏的病理变化, 减轻肝纤维化程度, 且影响着Bcl-2的表达水平, 其表达水平明显高于感染对照组和低剂量PTX组, 与吡喹酮组的表达水平相近. 但对Bax的表达水平无明显影响, 高剂量PTX组、低剂量PTX组、感染对照组、吡喹酮组等4组的Bax表达水平无显著性差异. 提示高剂量PTX可能通过促进Bcl-2表达, 减少肝细胞的变性坏死, 阻断血吸虫肝纤维化的发生. 本研究在分子水平上为PTX抗血吸虫肝纤维化作用提供了一理论依据. PTX抗血吸虫肝纤维化作用可能是多方面的, 有实验证实PTX可显著降低血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量[10]. 肝纤维化时Bcl-2在纤维间隔区表达高于其他区域[8,11], PTX对纤维间隔Bcl-2和Bax的作用与整个肝组织是否不同、对纤维间隔中的MFB凋亡有无促进作用等还有待于进一步研究. 目前认为肝纤维化发生的中心环节为肝星状细胞的激活, 因此, 抑制肝星状细胞的激活以及促进肝星状细胞的凋亡是防治肝纤维化的关键. 总之PTX有良好的抗肝纤维化效果及其极低的副作用, PTX也将可能成为临床预防和治疗血吸虫病肝纤维化的有用药物.

备注

$[Footnotes]

参考文献

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