功能基因组学中的功能缺失研究策略

摘要

N/A

关键词: N/A

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Correspondence to: N/A

Received: December 10, 2003
Revised: March 9, 2004
Accepted: April 28, 2004
Published online: October 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

在功能基因组学(functional genomics)研究中, 阐明各种蛋白的结构和生物学功能是其核心任务, 不仅是生物学的主要研究方向, 而且也是医学研究的主要内容, 毕竟细胞的功能和表型是由细胞中的蛋白来主导的, 许多疾病都是蛋白结构与功能、表达水平与调节的异常引起的. 研究蛋白的功能, 常常通过改变蛋白的表达水平, 观察细胞的生物学特性的变化, 来研究蛋白相应的生物学功能. 这种研究策略包括强制性地升高特定蛋白的表达水平, 也包括蛋白表达水平的缺失. 研究表明, 在功能基因组研究中, 功能缺失(loss of function, LOF)策略具有特殊重要地位.

1 反义寡脱氧核糖核苷酸和反义RNA

反义分子包括反义寡脱氧核糖核苷酸 (oligodeoxynucl-eotide, ODN)和反义RNA(antisense RNA)等. 反义技术(antisense technique)是指反义DNA/反义RNA分子作用及其机制研究的技术. 他是通过以碱基互补配对方式结合, 抑制、封闭或破坏目的基因结构及其表达的核酸分子, 利用反义技术可以了解特定基因的功能, 同样也可以利用反义技术抑制封闭某些有害或致病基因的表达, 在新一代抗病毒、抗肿瘤领域中具有巨大发展潜力[1].

反义(antisense)的概念早在1967年即被提出. 如果这核酸分子为DNA, 则称为反义DNA;如果这核酸分子为RNA, 则称为反义RNA. 反义DNA分子就是各种修饰或未经修饰的反义ODN片段. 1973年首先报道非离子型ODN及其衍生物, 能够特异性抑制细胞DNA复制、RNA的表达、转录、翻译功能. 1978年首次报道反义ODN可抑制劳氏肉瘤病毒(RSV)的复制. 当时应用的ODN是人工合成的未经修饰的反义ODN, 取得了意想不到的结果. 之后, 合成了多种反义ODN片段研究其对其他严重危害人类健康的病毒的抑制作用, 也取得了满意的结果. 目前认为, DNA双链其全长并不是从头到尾都处于双链结合状态, 这些非结合区域将可能成为反义ODN的结合部位. 另外反义ODN能与双链DNA结合形成局部三螺旋结构, 从而在转录水平抑制基因表达. 已有许多文献报道这种三螺旋结构在体外可抑制癌基因表达及猿猴病毒复制. 20年来大量研究证实反义ODN特异性抑制基因表达的能力, 人们也逐渐认识到其在疾病治疗方面的巨大潜能[2].

1.1 反义寡脱氧核糖核苷酸

反义ODN要发挥作用, 必须具备以下几个条件: ⑴ 稳定性: 反义ODN容易被体内外广泛存在的核酸酶破坏而失去活性, 故从策略上说, 反义ODN抗病毒治疗以基因表达途径更为有效. 因此反义ODN要发挥治疗作用必须通过化学修饰等以抵抗核酸酶的裂解增强其稳定性. 维持充分的细胞内浓度, 较长的细胞内半衰期; ⑵ 透膜性: 自然反义ODN的不易透过细胞膜而达到作用靶位, 经过修饰的反义ODN可以增加透膜性, 增强治疗作用. 目前有许多载体系统用于增加反义ODN对细胞的通透性, 和其靶向mRNA结合位点的释放, 如反义ODN结合到胆固醇、多聚赖氨酸及阳离子脂质体中, 在提高细胞对反义ODN的摄取方面, 阳离子脂质体的应用最广泛. ⑶ 特异性和亲和性: 影响特异性和亲和性的因素很多. 如反义ODN的序列、长度、作用环境中的温度离子等. ⑷ 低毒性: 注意选择无毒或低毒的反义ODN. 注意观察其对人体细胞的毒性. ⑸ 作用于病毒不同生活周期的多靶位反义ODN联合作用, 有可能比单靶位有更强的抑制作用, 可能提高抗病毒效果[3].

为了满足以上条件, 反义ODN可以进行结构上的化学修饰, 包括ODN的骨架修饰, 磷酸基修饰, 糖环修饰, 碱基修饰. 常用的是磷酸基修饰. 在单核苷酸的磷酸基中4个氧原子, 可以由其他化学基团替代, 可以明显增强核酸酶的抗性, 和细胞膜通透性, 经过修饰后的反义ODN可以增强抗病毒的活性. 无论是自然状态下的反义ODN还是化学修饰反义ODN, 其骨架中的五碳糖都是其他构型. 上述各种化学修饰反义ODN, 其着眼点在于提高其核酸酶的抗性, 增强其稳定性, 但同时也产生了另外一个问题, 这就是反义分子的过度累积, 造成的细胞毒害. 因此考虑到另外一种化学修饰的方式和类型. 即在反义ODN的两端进行化学修饰. 这样的目的是弥补DNA片段的不足之处, 解决更好地进入细胞, 更稳定, 特异地和靶mRNA结合并破坏掉该mRNA的问题. 如反义DNA 3'-端共价连接上胆固醇分子, 大大提高了细胞摄取量, 于是相应提高了反义DNA抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的活性.将补骨脂分子接到反义DNA上, 其目的是加强和靶mRNA. 结合的稳定性或进一步破坏掉mRNA, 使其丧失功能. 把反义RNA与核酶(ribozyme)串连成融和基因, 可同时具有反义抑制及剪接功能, 必定会提高反义ODN的抑制效率. 另外, 脂质体修饰能够明显增强硫代磷酸化ODN的反义抑制作用, 其原因可能与下面两个因素有关: ⑴脂质体使ODN的转染效率提高. ⑵修饰后可避免核酸酶的裂解增强其稳定性.用硫代磷酸化、硫代磷酸化和硫代磷酸化等基团修饰, 对丙型肝炎病毒(HCV)的复制均有较好的抑制作用, 并认为经过化学修饰的ODN类似物能抵抗核酸酶的裂解, 提高其生物活性[4].

现阶段的反义技术还存在很多问题. (1) 继续研究能高效抑制基因的复制和表达的靶序列, 设计和合成相应的反义ODN, 研究反义ODN的修饰, 提高反义ODN对核酸酶的抗性, 细胞膜的通透性, 增强对基因靶位的特异性和亲和性, 减少对细胞的毒性. (2)如果反义ODN没有封闭基因复制的原始模板, 一旦停止治疗, 将会引起复发, 这是一个值得研究的重要问题. (3)反义ODN目前主要靠人工合成, 合成量小. (4)反义ODN在应用人体前, 必须进行动物实验研究, 检验在活体中的有效性和安全性, 但选择合适的动物模型也是一个难题. 此外还面临其他方面基因治疗的共同问题, 如目的基因的选择, 病毒表达载体的安全性问题, 基因的选择及基因转移靶细胞的选择, 导入方法, 靶器官的特异性及治疗后如何调控导入基因的表达等还需深入研究[5].

由于反义技术能抑制基因的复制, 并在不同水平上阻断其功能的发挥, 因此是一种很有潜力的治疗方法, 反义技术的体外实验已初步证明了这一点. 也许在不久的将来, 反义技术能够真正成为治疗某些疾病的突破口, 如肿瘤、病毒性疾病、遗传病等. 反义基因治疗应用于临床将预示着一个新时代的来临[6-8].

1.2 反义RNA

1981年首次报道了天然反义RNA的存在及其生物学功能. 1983年又发现反义RNA不仅可以抑制DNA的复制, 而且可以调节基因的转录和翻译, 可以抑制基因表达, 是基因表达的调节因子. 在生物体内存在反义RNA, 由于反义RNA和mRNA互补, 可以抑制mRNA的翻译功能. 使基因的表达受到抑制. 1984年首次提出反义RNA的概念, 并用重组DNA技术设计和制备出反义RNA.利用重组DNA技术将编码单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因特异性反义RNA所对应的DNA的片段重组到一种真核表达载体中, 再将这种重组的反义RNA表达载体, 注射到细胞里, 明显观察到反义RNA的表达, 抑制了HSV的复制和表达活性及TK活性. 此后开展了反义RNA表达载体的构建, 以及转基因表达和抗病毒的研究. 反义DNA分子不象反义RNA分子除了化学合成以外, 别无其他来源, 不能采取基因工程技术生产, 或体内表达的基因治疗技术. 但反义DNA分子比反义RNA分子较容易得到, 也较稳定[9-11].

2 核酶

核酶是一类独特的RNA分子, 具有自我剪切和催化功能, 其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA, 催化裂解靶RNA, 抑制基因表达, 特别是抑制某些有害基因表达. 1983年两位科学家Cech和Altman发现了核酶. 核酶发现于对四膜虫以及一些植物病毒、类病毒等的观察. 他们的核酸分子都具有自我剪切的功能. 这些自我剪切反应都是可逆的, 具有酶催化反应的性质. 到目前为止, 至少提出三种不同的核酶活性中心的结构形式, 他们分别是锤头状, 发夹状, 斧头状结构. 这三种主要类型的核酶RNA分子, 其基本构成都是由活性中心及其侧翼序列组成, 核酶RNA的活性中心决定了酶的催化活性, 其侧翼序列决定了核酶RNA结合与裂解靶RNA的特异性. 以后根据这些天然核酶的结构, 人工合成具有催化活性的RNA片段(人工核酶). 核酶具有序列特异性, 不编码蛋白亦无免疫原性, 又可重复利用等优点．此外还可以通过体外转录的方式获得核酶RNA分子的表达[12].

核酶的发现及其研究不仅具有理论上的指导意义, 而且也具有极大的实用价值. 核酶的发现, 使反义技术发展到一个新的高度, 核酶RNA分子不仅为反义技术增添了新型分子, 而且其作用效率更高, 作用机制更复杂, 同时核酶RNA分子也是基因调控的重要分子. 结合一些基因的治疗手段, 对遗传病、癌症和病毒性疾病, 尤其对我国人民危害极大的病毒性肝炎开展基因治疗, 具有十分诱人的应用前景[13].

乙型肝炎病毒(HBV)为部分双链的DNA病毒. 其复制过程中有一个从前基因组RNA到DNA的逆转录过程. 如果以这段3.5 kb的前基因组RNA为靶子, 设计核酶对其进行降解就可以打断他的生活周期. 核酶能特异地切割HBV前基因组 RNA, 使其丧失模板活性. 1992年Weizker et al针对HBV前基因组RNA的一些关键部位设计了3个锤头型核酶, 与体外转录的全长RNA在50℃ 温育, 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示RNA被切割成不同长短的片段, 与预测的长度相符. 为了排除非特异性切割或RNA的降解作用, 他们还把冷的RNA与核酶放在一起, 此时就不会出现以上的片段. 还发现3个核酶同时切割的效果明显大于单个核酶的效果, 这可以用来对抗病毒的变异. Beck et al所设计的核酶针对HBV前基因组RNA的包装信号, 他是一个高度保守的、茎环结构的顺式因子, 在基因组中出现了2次, 他对病毒的包装及反转录都起着很重要的作用. 根据这些特点被认为是比较理想的靶子. 竺来发et al设计针对HBcAg mRNA编码序列的核酶, 在Mg²⁺存在下, 将137 nt的核酸准确地了解得到97 nt和40 nt两个片段, 可有效的剪切HBV mRNA. 王平et al针对HBV前-C／C区基因的锤头状核酶, 经体外转录后可定点切割靶RNA, 在HepG2细胞亦可显著抑制 HBeAg、HBsAg的表达和HBV DNA复制; Weizsacker et al构建了串联的核酶, 针对HBV mRNA第2029-2031 nt, 2044-2046 nt和2049-2051 nt位点设计的3组锤头状核酶, 可有效的切割靶RNA, 抑制或阻断HBV的复制, 并可减少变异病毒逃逸的机会. Beck et al设计了针对HBV包装点的锤头状核酶, 体外切割靶RNA, 用U6 snRNA表达核酶与HBV共转染, 也可有效切割靶RNA. 国内体外合成核酶, 并对鸭HBV S基因体外转录物定点切割, 发现对病毒抗原表达的抑制作用. Welch et al使用三个发夹状核酶, 在Huh7细胞中与HBV共表达, 使其HBV表达下降66%, 对核酶修饰后则抑制率达83%. 在真核细胞表达的成功, 预示对HBV基因治疗是有效的[14-15].

和文超et al针对HBsAg、HBcAg、HBeAg设计了5种锤头型核酶, 不仅在细胞外, 而且在细胞内观察到了其对HBV的抑制, 各抗原及病毒颗粒都明显减少.设计的核酶构建了带有5'-、3'-自身修剪的真核细胞核酶表达质粒, 包括含单个核酶和多个串联的鸟枪型核酶基因的质粒, 通过转染把他们同带有HBV基因组的质粒转入HepG2细胞. 用Southern blot、ELISA、RNase保护法等测定结果后, 显示HBsAg、HBcAg、HBeAg以及他们相应的RNA、Dane颗粒数都因为核酶的作用而明显地减少[16].

Puthtz et al学者用重组筛选的方法从一个发夹型核酶文库中(5×10⁹个)确定能有效地在转基因人肝癌细胞(HCC)中切割HBV前基因组RNA的核酶. 这个核酶文库包含了任意序列的底物结合位点. 通过实验发现RNA上有40个部位可以和核酶结合, 其中17个在HBV所有4个亚型中都存在. 然后他们根据这17个保守位点设计了4个发夹型核酶, 与一个有复制活性的HBV DNA二聚体同时转入 HCC细胞系中. 结果核酶对 HBV的抑制分别达到80%、69%、66%和49%[17].

HCV是一种RNA病毒. 用目前的抗病毒手段非常容易诱导变异从而产生耐药性. HCV基因组核心区高度保守, 其5'-NCR含有惟一的翻译起始点, 且全长5'-NCR对病毒复制和装配也必不可少, 因而抗-HCV核酶设计是针对C区和 5'-NCR以及针对mRNA二级结构的单链间隙, 在细胞内外均能抑制HCV病毒RNA的复制. 对于HCV的感染, Weich et al使用发夹式核酶作为抗HCV感染的有效治疗物质, 以阻碍病毒基因组复制, 阻止病毒蛋白的表达．保护细胞免受HCV感染. 该核酶针对5'-NCR及编码衣壳蛋白的区域. 由于5'NCR区的二级结构相对复杂, 影响了核酶的结合. 使得编码HCV衣壳蛋白区域的核酶成为目前最有希望的抗HCV核酶.首先使用的是RNA强子, 而非DNA增强子. 也曾有应用锤头状核酶清除肝细内HCV RNA的报道, 并在HCV RNA的AUG启动子附近发现了核酶的切割位点. 该方法是通过HCV感染的肝细胞培养建立的核酶文库选择合适的核酶切割位点, 因此可能对寻找HBV的核酶酶切位点也很有帮助. Welch et al针对HCV正链与负链RNA高度保守的区域设计了多个核酶. 在体外比较了他们对RNA的切割活性. 挑选了其中几个最有效的核酶, 连接入腺相关病毒(AAV)载体和腺病毒载体. 发现他们在组织培养中对HCV病毒有非常明显的抑制作用. 这一结果为将来研制抗HCV药物带来了希望. Welch et al还设想可以将这种核酶插入嗜肝病毒载体静脉注射入人体, 使其在人体肝细胞中不断地释放出来, 降解 HCV RNA正链甚至负链. 贾战生et al研究抗HCV 5'-NCR双位点213和260核酶在细胞内对HCV翻译启动功能的抑制作用. 通过脂质体介导的基因转染方法, 转染核酶基因和带萤虫素酶的靶基因真核表达载体于人肝癌细胞, 检测报告基因的活性, 结果表明两种核酶均能在肝癌细胞内有效地抑制报告基因的表达, 其抑制率在40-75%之间．国内刘克洲et al设计和合成HCV 5'-NC区和Ｃ区的特异性核酶基因并克隆入真核表达载体pSV2-gpt、CD-Sra中, 转染HCV感染的MT-2细胞, 用定量PCR方法检测核酶对HCV的抑制作用, 结果显示两种核酶对HCV均有抑制作用, 抑制率分别为54%和62%, 二者联合作用时抑制率达78%[18-19].

丁型肝炎病毒(HDV)的基因链和抗基因链均具有核酶活性, 能催化自我切割和自我连接, 他最可能是导致核酶活性的结构. HDV基因组自身裂解位点位于688/689 nt位置上, 斧头状核酶就是根据HDV核酶结构提出的. 抗HDV核酶技术包括阻断这种自身剪切过程, 另一方面, 设计其他核酶分子裂解HDV RNA基因组. 在抗HIV核酶研究中, 设计多靶位核酶切割病毒的RNA, 到目前为止, 已设计出HIV RNA特异性的９个靶位的核酶RNA分子, 这样避免了单个核酶识别, 切割位点的基因突变造成的切割失败, 同时也提高了抗病毒效率[20].

影响核酶催化活性的因素主要有: (1) 二价金属阳离子(如Mg²⁺、Ca²⁺). 核酶的裂解反应, 至少要有0.5 mmol/L的Mg²⁺或Ca²⁺存在. Mg²⁺以一种独特的方式促进核酶的裂解反应, 当其浓度在25 mmol/L以上时．裂解活性迅速增加. 有人认为在Mg²⁺浓度较高时. 核酶可能变成了另一种构型. (2) 变性剂. 当低浓度变性剂存在时可以增强核酶的催化活性, 而高浓度变性剂(>2M的尿素或 >5M的甲酰胺)存在时可抑制核酶的催化活性. (3) 温度. 适当的温度可增强核酶的催化活性. (4) 酸碱度三种基因结构类型的核酶RNA分子, 其反应条件中的最佳pH值是7.0, 反应环境过酸, 过碱都将影响核酶RNA活性中心的形成, 进而影响催化效率. 在所有的因素中, 二价金属阳离子是绝对需要的. Beck et al报告, 在抽提的细胞而不是完整的细胞中, 锤头状核酶能有效地切割HBV的壳膜信号. 体外试验表明, 经过蛋白K酶和酚抽提处理的细胞, 随着MgCl2浓度的提高, 胞外终浓度达5-10 mmol/L(胞内MgCl2浓度为l mmol/L)时, 该酶的切割效率是最高的. 核酶一底物复合物活性是通过核酶结构的改变来实现的, MgCl₂浓度的高低是诱导核酶结构变化的关键, 因此细胞内MgCL₂浓度可影响靶RNA(如HBV壳膜信号)的延伸. 由于HBV前基因组转录的结果是使HBV RNA不断合成, 因此在HBV前基因组内更容易找到核酶的切割位点[21].

为了使核酶成功地用于临床, 首先要从以下几方面进行研究. (1) 设计最佳的核酶结构首先要确定核酶的类型．锤头状核酶对靶序列的要求稍低, 且分子较小, 易于获得较高产量, 也较经济, 是目前广泛使用和首选的类型, 其次是选择靶RNA, 核酶的作用效率与其裂解的靶序列有关, 不同的NUH(N为A、C、G, U; H为A、C和U)序列能使其裂解效率改变100倍以上. 锤头状核酶包括二个侧翼的臂, 核酶可以借助该臂识别产底物的NUH序列, 然后催化核酶裂解RNA 3'-端的NUH三联子. 发夹状核酶识别的裂解位点位于GUC的上游．发夹状核酶二级结构中某些碱基的变化, 可导致核酶裂解活性的全部丧失. 斧头状核酶裂解位点位于GAU的下游, 是从研究HDV基因组复制过程中阐明的. 核酶RNA分子活性中心及其侧翼序列的组成和数目对核酶RNA分子都有影响. 设计核酶RNA分子要注意防止自身折叠成稳定的二级结构. 裂解靶位的选择应尽量避开茎－环稳定的二级结构, 而应选择较为松散的单链结构区, 以达到理想的治疗效果, 对核酶RNA的侧翼序列, 从理论上讲, 最好要保证侧翼序列的长度在17 nt以上, 以保证其与底物 RNA分子结合的特异性. (2) 寻找有效的导入及表达系统最常用的载体是选择病毒载体系统, 如腺病毒载体或逆转录病毒载体. 在核酶表达载体的选择与构建中, 要考虑启动子本身活性的强弱及其组织细胞特异性问题. (3) 提高核酶在细胞内的稳定性, 为了稳定核酶在细胞内的结构, 可对核酶结构进行化学修饰. 在体外许多研究针对2'-OH进行修饰, 以增加核酶的稳定性. 如Taylor et al设计的DNA-RNA杂合核酶, 即与底物配对部分用脱氧核苷酸替代, 结果其体外活性提高６倍, 稳定性提高２倍．Heidenreich et al则以2'-氟替代, 发现提高了稳定性但也降低了剪切活性, 亦有以2'-甲基, 2'-脱氧基, 2'-氨基, 磷硫替代等修饰的报道．核酶在细胞内提高稳定性则通过装在tRNA反密码环或在核酶末端引入茎环结构来进行. ⑷ 改善和提高核酶活力, 减少影响核酶作用效率的因素. 多位点核酶联合可以提高核酶的剪切率, 可以阻止病毒变异逃逸核酶的攻击, 和减少空间构型的影响. 如Weizsacker et al所用3个核酶的串联作用. 核酶也可以与反义技术相结合, 或与定向技术相结合, 如HBV外膜蛋白包装含有HDV核酶的毒株, 可使其定向作用于靶器官肝脏. 日本学者设计抗HCV核酶, 使用唾液粘蛋白定向等[22].

目前核酶在体内应用研究已取得了很大的进展, 但多数研究仍处于实验阶段, 要使核酶真正用于疾病的防治, 仍有很长的一段路要走．包括核酶如何导入细胞与表达, 核酶引入细胞后的稳定性, 核酶结构的设计, 底物的选择以及如何提高核酶的活力及调控等方面均有待于进一步探索和解决. 从基因水平探索治疗肝病有效途径是寻找新一代高效无毒药物的根本出路.研究根据靶基因模板序列, 设计出高度特异的"基因封条"封闭病毒基因表达的特定部位, 对细胞代谢无影响, 是一个值得重视的探索方向.

3 RNA干扰

从基因的分子生物学角度, 病毒性肝炎也是一种基因病, 相对于正常肝细胞来说, 肝炎患者的肝细胞中获得了肝炎病毒的基因, 因此, 病毒性肝炎的治疗也可以采取像遗传病那样的基因治疗(gene therapy)策略[23]. 与遗传病的基因治疗策略不同, 遗传病往往是因为某一或某些基因发生缺陷, 利用基因治疗技术进行补充或者校正; 而病毒性肝炎的基因治疗, 往往是需要采取另外的策略, 即阻断有害的病毒的基因表达的策略. 因为病毒性肝炎的发病机制, 主要是进入肝细胞的肝炎病毒基因编码产生相应的肝炎病毒蛋白, 作为靶抗原激活机体的免疫应答机制, 这种原本是要清除肝细胞中肝炎病毒的正常的免疫应答机制, 却造成了持续的肝细胞的免疫损伤, 引起各种类型的肝脏疾病. 特别是HBV、HCV感染引起的慢性病毒性肝炎, 迁延不愈, 释放的各种炎症因子导致肝脏内贮脂细胞(stellate cell)细胞的激活、转化、增生, 分泌过量的细胞外基质(ECM), 并造成肝脏纤维化的形成, 某些情况下通过复杂的生物学机制导致肝细胞的恶性转化, 引起肝细胞癌的发生[24]. 因此, 从肝炎病毒引起的一系列肝脏疾病谱来看, 主要的源头就是肝细胞中肝炎病毒基因的存在, 因此采用基因治疗技术阻断肝炎病毒基因在肝细胞中的复制和表达, 是我们应该考虑的主要治疗靶点.最近研究表明, RNA干扰(RNA interference)可能是进行抗肝炎病毒基因治疗的新的策略[25].

3.1 RNA干扰的机制与策略

1995年Guo和Kemphucs et al在研究美丽隐杆线虫(C. elegans)的par1基因功能时, 将par1基因的反义RNA表达载体导入到美丽隐杆线虫中, 引起par1基因的缺陷现象, 同时发现导入par1基因的有义链基因进行表达时, 也产生了par1基因的缺陷现象, 表明反义和有义RNA的表达都有类似的抑制效应, 但是机制却明显不同. Fire et al对这一现象的机制进行了细致深入的研究, 比较了反义RNA、有义RNA和双连RNA(dsRNA)在美丽隐杆线虫中的抑制效应, 发现dsRNA产生至少是10倍以上的抑制靶基因表达的效果, 并将dsRNA抑制同源基因的表达的现象称为RNA干扰, 从此RNA干扰现象得到了空前的重视, 并在各种病原微生物的基因表达抑制方面进行了许多有益的尝试[26].

3.2 RNA干扰与病原微生物基因表达的抑制

首先在美丽隐杆线虫中发现RNA干扰现象之后, 很快发现在许多类型的病原微生物中都存在同样的RNA干扰现象. 22-25 nt大小dsRNA产生抑制或降解靶RNA分子的作用, 统称为小干扰RNA(small interference RNA, siRNA), 根据其发挥RNA干扰现象的dsRNA的具体长度又可以分成2类: 24-25 nt的长siRNA和21-23 nt的短siRNA. 这两种类型的siRNA都可以通过与靶mRNA分子进行序列特异性的结合、抑制与降解, 阻断或破坏靶基因的表达. 另外一种可能作用的机制就是dsRNA诱导同源基因的甲基化, 从而使目的基因表达关闭. 另外, 小分子的dsRNA同时也是很强的干扰素诱导酶如PKR、RNase L的激活剂, 可以产生类似干扰素的抗病毒效应[27].

3.3 RNA干扰与抗肝炎病毒治疗的应用前景

RNA干扰策略在抗肝炎病毒治疗中首先在HCV的研究中获得了成功. McCaffrey et al设计合成了针对HCV NS5B基因区的dsRNA, 当与NS5B表达载体进行共转染时, 在鼠肝细胞中观察到dsRNA对于NS5B基因的表达水平抑制率达到75%, 如果dsRNA与NS5B的表达载体进行共转染, 抑制率可以达到98%. 说明siRNA策略在抗HCV基因治疗中的应用前景. 多年来由于缺乏合适的HCV感染/转染细胞模型, 因此对于抑制HCV的研究进展缓慢. 近年来关于HCV复制子(replicon)的建立, 使得在细胞系水平上研究siRNA的效果成为可能. Randall et al就利用HCV的复制子细胞模型对于dsRNA抑制HCV RNA复制的效果进行了研究. 在Huh-7细胞系中, dsRNA对于HCV RNA的复制水平具有显著的抑制作用, 而且是剂量依赖性的. 对于dsRNA作用的序列依赖性的特点进行研究, 2株HCV变异株仅有3 nt的序列差别, 只有dsRNA与作用的靶HCV RNA序列完全同源时才具有抑制作用, 因此, dsRNA对于靶基因的表达抑制是严格的序列特异性的特点. dsRNA对于HCV RNA抑制的作用效果是指数性的, 在4 d之内, 就可以降低HCV RNA的复制水平达80倍. 导入siRNA之后, 可以使98%以上的有HCV RNA复制的细胞不再有HCV RNA的复制, 这些细胞中再也检测不到HCV的抗原表达和HCV RNA的复制. 这些研究结果表明, 基于siRNA的抗HCV 治疗是十分有希望的[28].

当然, 由于肝炎病毒RNA分子在体内的二级结构特点, 针对不同基因区段的siRNA的抑制作用效果也肯定有所差别, 因此针对HBV、HCV基因序列的特点, 还需要进行优化, 寻找最为有效的抑制靶点. 作为一种新型的抗肝炎病毒的可能的策略, siRNA也具有其相当明显的局限性. 例如HBV和HCV基因序列高度变异, 存在明显的基因准种(quasispecies)群, 而siRNA对于靶RNA分子的识别, 又是以碱基配对方式进行的, 因此要向全面控制HBV、HCV的复制, 我们就需要无数种序列不同的siRNA分子, 显然是很难做到的. 因此, 我们还必须针对这一特点进行深入细致的研究, 克服这一困难, 使得siRNA抑制靶基因的表达的策略, 更能切合临床抗肝炎病毒治疗的需要[29-33].

4 基因敲除

基因敲除(gene knock-out)模型是目前功能是研究策略中的主要技术途径之一. 建立基因敲除的动物模型, 基本上通过2种策略: 一种是体外构建同源重组或基因打靶(gene targetting)的表达载体, 利用受精卵细胞核微注射的方法, 依靠受精卵细胞内的基因同源重组, 实现基因敲除. 这一策略的缺点就是效率太低. 随着体细胞核移植技术即克隆动物模型技术的研究进展, 目前采用体外构建同源重组或基因打靶载体, 在体外条件下对于实现同源重组的细胞系进行选择鉴定, 然后进行体细胞核移植, 将是基因敲除模型发展的主流技术方向[34].

基因敲除是指对一个结构已知但功能未知的基因, 从分子水平上设计实验, 将该基因去除, 或用其他顺序相近基因取代, 然后从整体观察实验动物, 推测相应基因的功能. 这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似.基因敲除除可中止某一基因的表达外, 还包括引入新基因及引入定点突变. 既可以是用突变基因或其他基因敲除相应的正常基因, 也可以用正常基因敲除相应的突变基因[35].

基因敲除是1980年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术. 1980年代初, 胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础. 1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础. 到1987年, Thompsson et al首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型. 此后的几年中, 基因敲除技术得到了进一步的发展和完善.基因敲除的技术路线如下: (1) 构建重组基因载体; (2) 用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内; (3) 用选择培养基筛选已击中的细胞; 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物, 对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测[36].

基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞. 基因敲除的技术路线虽不复杂, 但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低, 约为百万分之一, 要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作. 因此, 同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题. 目前已有多种筛选方法, 其中1988年犹他大学的Capecchi et al教授的研究组发展的"正负双向选择系统"适用范围宽且效率较高. ES细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术的成熟, 首次使体外精细的基因操作与小鼠的整个生长发育和生命过程得到了直接的结合, 为探讨高等动物基因组结构和功能提供了有效的方法. 由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对哺乳类生物学的各领域, 包括发育生物学、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗传学产生了极大影响. 理论上, 基因敲除可适用于任何能产生ES细胞的物种, 将来可在小鼠基因敲除成熟的基础上开展其他实验动物的基因敲除工作[37].

基因敲除的应用领域主要有: (1) 建立人类疾病的转基因动物模型, 为医学研究提供材料基因敲除小鼠是研究疾病的发生机 制、分子基础及诊断治疗的重要实验材料. 如1989年囊性纤维化病(CF)的致病基因(CFTR)被成功地克隆, 1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型, 为CF基因治疗提供了很好的动物模型, 得以顺利通过了通过了基因治疗的动物试验, 于1993年开始临床试验并获得成功. (2)改造动物基因型, 鉴定新基因和/或其新功能, 研究发育生物学深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现, 可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用, 为研究基因的功能和生物效应提供模式. 例如, 目前人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手, 进而用基因敲除法在小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化. 目前已报道了多种学习、记忆以及有缺陷的基因敲除动物, 发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少. (3)治疗遗传病. 这包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的. (4)改造生物、培育新的生物品种细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破, 而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃. 这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景[38-42].

基因敲除技术在国外已是成熟技术, 国内还仅仅是刚刚开始. 但是, 国内已有几家单位在这一领域开展了一些工作. 例如, 利用基因敲除系统, 国内研究了Smad3 基因的功能, 成功地鉴定了3 个与骨骼发育有关的新基因, 探讨了肿瘤坏死因子受体Ⅱ在郎格罕细胞迁移中的作用、CD45蛋白酪氨酸磷酸酶与小鼠表皮gdT 细胞发育的关系, 研究了极低密度脂蛋白和中间密度脂蛋白与动脉硬化的关系, 将小鼠胚胎干细胞中凝血因子 Ⅸ(mFⅨ)基因定向敲除, 为建立血友病B的转基因小鼠模型奠定了基础[43-44].

5 显负性突变体策略

蛋白以及蛋白之间的相互作用决定了蛋白的生物学功能及细胞的表型. 一种结构发生变化而失去其正常的生物学功能的蛋白质分子, 往往与其相应的野生型蛋白进行竞争性的抑制, 从而阻断野生型蛋白的生物学功能. 这种具有竞争性抑制野生型蛋白分子生物学功能的突变体称为显负性突变体(dominant negative mutant).显负性突变体在生物学研究中具有广泛的应用前景[45-47].

HBV基因组编码2种反式激活因子: HBxAg和羧基末端截短型的表面抗原中蛋白(MHBst). 这2种反式激活蛋白都激活c-Raf-1/MEK激酶信号转导链. HBxAg信号转导需要蛋白激酶C(PKC)和Ras的共同参与, 但是MHBst仅需要PKC, 而不需要Ras. 单独阻断HBxAg或MHBst的信号转到途径, 并不能减少转染的HepG2细胞中的病毒的产量, 但是利用c-Raf-1- 或MEK显负性突变体抑制剂将2种反式激活因子的共同信号转导通路进行阻断, 则可以阻断HBV的基因表达.

持续的HCV复制说明HCV具有抑制机体的防御体系的功能. 研究表明HCV NS3/4A蛋白酶可以阻断干扰素调节因子-3(IRF-3)这种抗病毒关键效应分子的磷酸化修饰和生物学功能. IRF-3 显负性突变体的表达可以提高肝癌细胞中的HCV RNA的复制水平. HCV NS5A蛋白是一种具有催化多种蛋白磷酸化修饰的蛋白, 因而参与不同的细胞信号转导系统. 在其羧基末端高度保守的II型多脯氨酸结构位点SH3位点与Src蛋白家酪氨酸激酶族以及有丝分裂原接头蛋白Grb2的结合, 产生多种生物学调节作用.

TNFa可以诱导肝细胞的细胞凋亡, 也可以诱导肝脏的再生过程, 但是具体机制不清. 应用基因芯片技术对于TNFa有道德基因类型进行研究, 发现对白介素-8(IL-8)是诱导水平是最高的. 但是应用一种显负性突变体IkB、没有激酶活性的Akt突变体阻断NF-kB和PI3K/Akt信号转导通路, 或应用LY 294002 特一行阻断PI3K时, TNFa对IL-8的上调作用消失. 提示负显性突变体的构建是研究信号转导的重要技术手段.

备注

$[Footnotes]

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