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氧化苦参碱对HBV转基因鼠HBV抗原表达的抑制作用
陆伦根, 曾民德, 茅益民, 李继强, 邱德凯, 沈朝晖, 宋育林, 曹爱平
陆伦根, 曾民德, 茅益民, 李继强, 邱德凯, 沈朝晖, 宋育林, 曹爱平, 上海第二医科大学附属仁济医院, 上海市消化疾病研究所 上海市 200001
陆伦根, 男, 1965-11-09, 江苏省扬州市人, 博士, 副教授, 副主任医师, 主要从事消化系疾病尤其是肝脏疾病的基础和临床研究. 发表论文50篇, 主编专著2部, 参编专著20篇, 获上海市和教育部科技成果奖3项.
ORCID number: $[AuthorORCIDs]
基金项目: 上海市医学发展基金重点研究项目, No. 99ZDI001; 1999年中华肝病学会中青年肝病科研基金.
通讯作者: 陆伦根, 200001, 上海市, 上海第二医科大学附属仁济医院, 上海市消化疾病研究所. lulungen@online.sh.cn
电话: 021-33070834 传真: 021-63364118
收稿日期: 2003-04-07
修回日期: 2003-05-01
接受日期: 2003-05-16
在线出版日期: 2004-01-15
目的: 研究氧化苦参碱对HBV转基因鼠表达HBsAg, HBeAg, HBcAg的抑制作用, 探讨氧化苦参碱抗HBV的机制.
方法: 用显微注射法建立HBV转基因鼠动物模型, 并进行HBV整合和表达鉴定. 获得的HBV复制型转基因鼠随机分成3组, 分别用生理盐水(9只), 氧化苦参碱50 mg/kg (8只)和100 mg/kg (9只)腹腔注射, 1次/d, 30 d后处死, 取肝组织定量测定HBsAg和HBeAg的量, 免疫组织化学观察肝组织表达HBsAg和HBcAg.
结果: HBV 转基因鼠经氧化苦参碱治疗后, 与生理盐水组相比, 肝脏组织HBsAg的量有所降低, 但统计学无显著差异(F = 1.29, P>0.05); 而HBV 转基因鼠经氧化苦参碱高和低剂量组治疗后, 肝脏组织HBeAg量明显降低(F = 9.09, P<0.01), 但在氧化苦参碱高和低剂量组之间无显著性差异(F = 1.58, P>0.05). 肝脏组织免疫组化HBsAg和HBcAg检测结果显示生理盐水组, 氧化苦参碱低和高剂量组肝组织内HBsAg阳性细胞数变化不明显, 统计学无显著性差异(x2= 1.61, P>0.05). 氧化苦参碱高剂量组肝组织内HBcAg阳性细胞数明显低于生理盐水组(x2= 4.73, P<0.05), 而生理盐水组与氧化苦参碱低剂量组, 氧化苦参碱低和高剂量组之间均无显著性差异.
结论: 氧化苦参碱对HBV转基因鼠HBV的表达有抑制作用.
关键词: N/A
引文著录: 陆伦根, 曾民德, 茅益民, 李继强, 邱德凯, 沈朝晖, 宋育林, 曹爱平. 氧化苦参碱对HBV转基因鼠HBV抗原表达的抑制作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 89-92
Inhibitory effect of oxymatrine on expression of hepatitis B virus in HBV transgenic mice
Lun-Gen Lu, Min-De Zeng, Yi-Min Mao, Ji-Qing Li, De-Kai Qiu, Zhao-Hui Shen, Yu-Lin Song, Ai-Ping Cao
Lun-Gen Lu, Min-De Zeng, Yi-Min Mao, Ji-Qing Li, De-Kai Qiu, Zhao-Hui Shen, Yu-Lin Song, Ai-Ping Cao, Shanghai Institute of Digestive Disease, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001, China
Supported by: the Key Project of Shanghai Medical Development Foundation, No. 99ZDI001 and grants from 1999 Youth Liver Diseases Foundation of Chinese Liver Diseases Association.
Correspondence to: Lun-Gen Lu, Shanghai Institute of Digestive Disease, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001, China. lulungen@online.sh.cn
Received: April 7, 2003
Revised: May 1, 2003
Accepted: May 16, 2003
Published online: January 15, 2004
AIM: To study the inhibitory effect of oxymatrine on HBsAg, HBeAg, and HBcAg expression in the liver tissue of HBV transgenic mice, and to further expound the mechanisms of oxymatrine anti-HBV.
METHODS: HBV transgenic mice models were established by microinjecting methods, and detected by HBV DNA integration and replication. Replicating HBV transgenic mice were divided into three groups: injected with normal saline (n = 9), 50 mg/kg (n = 8) and 100mg/kg (n = 9) oxymatrine intraperitonealy once a day for 30 d, respectively. After treatment, detection of HBsAg and HBeAg by ELISA, HBsAg and HBcAg by immunohistochemistry in the liver tissues was conducted.
RESULTS: Compared with group normal saline, HBsAg content in 50 mg/kg and 100 mg/kg oxymatrine decreased, but there was no statistic significance (F = 1.29, P>0.05). Compared with normal saline group, HBeAg content in 50 mg/kg and 100 mg/kg oxymatrine groups obviously decreased(F = 9.09, P < 0.01), but there was no obvious significance between 50 mg/kg and 100 mg/kg oxymatrine groups (F = 1.58, P> 0.05). The number of HbsAg-positive cells in the normal saline group, 50 mg/kg and 100 mg/kg oxymatrine had no changes in the liver tissues (x2 = 1.61, P> 0.05). The number of HBcAg-positive cells in the liver tissues was significantly lower in the group of 100 mg/kg oxymatrine than that in the group of normal saline (x2= 4.73, P < 0.05), but the number between normal saline group and 50 mg/kg oxymatrine group, and between the groups of 50 mg/kg and 100 mg/kg oxymatrine had no obvious significance.
CONCLUSION: There is an inhibitory effect of oxymatrine on expression of hepatitis B virus in HBV transgenic mice.
Key Words: N/A
0 引言
目前对慢性乙型病毒性肝炎尚缺少特效治疗方法, 所以寻找新的有效抗病毒药物, 仍为当务之急[1-12]. 大量基础和临床研究证实, 氧化苦参碱能抑制柯萨基病毒(一种RNA病毒)的蛋白合成, 从而具有直接抗病毒作用.体外实验表明, 氧化苦参碱对HBV DNA转染的细胞株2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有抑制作用. 临床研究发现其可用于治疗慢性乙型病毒性肝炎及其引起的肝纤维化[13-24]. 因此, 氧化苦参碱具有抗乙型肝炎病毒的作用, 有较好的临床应用前景. 我们研究氧化苦参碱对HBV转基因HBV抗原的表达影响, 为氧化苦参碱抑制乙型肝炎病毒提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料
质粒 p1.0HBV由中国科学院生物化学研究所吴祥甫教授惠赠, 3.2 kb的adr型HBV全基因组DNA克隆在pUC18载体BamHI酶切位点上. 试验用小鼠购自扬州大学实验动物室8周龄以上的性成熟ICR小鼠, 饲养环境为清洁级动物房. HBV转基因鼠的制备方法按文献[南京师范大学学报自然科学版1995; 18(增刊): 129]所述. HBV转基因鼠于4周龄剪尾0.1-0.5 cm, 以组织消化液消化, 饱和苯酚/氯仿抽提DNA, 行PCR扩增, PCR所用引物为I: 5'-AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTT-3'和II: 5'-TACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3', 扩增片段位于HBcDNA区域, 长度为470 bp.反应循环如下: 93 ℃变性60 s, 60 ℃退火45 s, 72 ℃延伸60 s, 35次循环, 最后72 ℃延伸增加10 min. 取1/10扩增产物进行电泳鉴定. Amplicor HBV Monitor检测试剂盒购自Roche Diagnostic Systems, Inc. HBV转基因鼠的表达鉴定的具体步骤按说明书推荐的方法进行. 从HBV转基因整合阳性的鼠取血, 用后眼眶静脉丛取血法收集血清, 抽取DNA后, 行PCR. 上游引物序列如下: 5'-GTTGCCCGTTTGTCCTCTAC-3', 下游引物5'端以生物素标记, 序列如下: 5'-Biotin-GATGATGTGGTATTGGGGGC-3'. PCR扩增条件为, 94 ℃变性5 min; 94 ℃变性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 30次循环, 最后72 ℃延伸增加5 min. 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实存在目的条带, 再行产物杂交鉴定. 实验用药物为氧化苦参碱注射液(博尔泰力注射液), 由宁夏博尔泰力药物有限公司宁夏药物研究所提供, 批准文号: 宁卫药准字(1994)第000029号, 批号: 20001214.
1.2 方法
取鉴定的8-12周龄HBV转基因鼠26只, 雌雄不分随机分为3组, 生理盐水组(9只), 氧化苦参碱低剂量组(8只)和氧化苦参碱高剂量组(9只), 分别予生理盐水, 氧化苦参碱50 mg/kg和氧化苦参碱100 mg/kg, 腹腔注射, 1次/d. 治疗30 d后处死小鼠, 分别取肝脏组织进行匀浆抽提蛋白, 测定组织中HBsAg和HBeAg量, 肝组织固定后免疫组化检测HBsAg和HBcAg. (1)ELISA检测肝组织中HBsAg和HBeAg.取HBV转基因小鼠肝脏组织1-2 g置于蛋白抽提液匀浆抽提蛋白质. 运用紫外分光光度仪测定蛋白抽提液中的蛋白质浓度, 分别测定样品在260 nm和280 nm的光密度值, 计算二者的比值, 并且按照如下公式计算蛋白质浓度: 蛋白质浓度(g/L)= F×OD280×稀释倍数. 检测HBsAg和HBeAg的ELISA试剂盒购自上海华美生物工程公司, 具体检测方法按试剂盒推荐的方法进行. 为使检测结果有较强的可比性, 每孔所加的总蛋白的量基本相同. (2)免疫组织化学检测肝组织中HBsAg和HBcAg.兔抗人HBsAg、生物素化的羊抗兔、羊抗人HBcAg、生物素化的兔抗羊均购自福州迈新生物工程公司. 每次实验均设阳性对照和阴性对照, 阳性对照以人肝组织HBsAg和HBcAg阳性作为阳性对照, 结果显示为阳性; 阴性对照以PBS代替一抗, 结果显示阴性.
统计学处理 测定值以mean±SD表示. 用SAS软件包Dunnett's检验和秩和检验进行统计学处理. P<0.05为差异有显著性.
2 结果
我们所用的396只HBV转基因鼠中, 共检测到HBV DNA整合转基因鼠137只, 占34.6%, 其中血清中复制HBV DNA的转基因鼠共26只, 占6.6%.
ELISA检测肝组织匀浆中HBsAg和HBeAg 氧化苦参碱治疗后HBV 转基因鼠肝脏组织匀浆HBsAg(A: 2.18±0.47和2.12±0.42), 与生理盐水组相比(A: 2.46±0.55), 虽有所降低, 但统计学无显著差异(F = 1.29, P>0.05).氧化苦参碱治疗后HBV 转基因鼠肝脏组织匀浆HBeAg(A: 0.52±0.13和0.42±0.19), 与生理盐水组相比(A: 0.74 ± 0.15), HBV 转基因鼠经氧化苦参碱高和低剂量组治疗后, 肝脏组织HBeAg量明显降低(F = 9.09, P<0.01), 但在氧化苦参碱高和低剂量组之间无显著性差异(F = 1.58, P>0.05).
免疫组织化学检测肝组织中HBsAg和HBcAg HBsAg和HBcAg阳性在肝细胞内呈棕黄色, 依据肝组织内阳性细胞数可分为三级: 肝组织内仅有个别散在的阳性细胞为+, 除了散在的阳性细胞外, 可见少数成群的阳性细胞为++, 出现多数成堆的阳性细胞为+++. 生理盐水组, 氧化苦参碱低和高剂量组肝组织内HBsAg阳性细胞数变化不明显, 统计学无显著性差异(x2= 1.61, P>0.05). 生理盐水组、氧化苦参碱低和高剂量组的HBcAg检测0, +, ++, +++分别为0, 1, 4, 4; 3, 3, 2, 0和4, 4, 1, 0例. 氧化苦参碱高剂量组肝组织内HBcAg阳性细胞数明显低于生理盐水组(x2= 4.73, P<0.05), 而生理盐水组与氧化苦参碱低剂量组, 氧化苦参碱低和高剂量组之间均无显著性差异.
3 讨论
Chisari et al[25] 通过受精卵显微注射法, 建立的能表达HBsAg的转基因小鼠模型, 为抗HBV药物的筛选研究开辟了新的途径. Morrey et al[26,27]利用已知对HBV感染有明确疗效的拉米呋啶和无效的zidovudine对高水平复制HBV转基因小鼠进行干预试验, 证实了这种小鼠作为抗病毒药物筛选模型的可行性. 我们用显微注射法建立的HBV转基因鼠进行实验, 结果显示HBV基因组DNA已整合至小鼠基因组, 且能有效表达, 证明获得了携带HBV全基因组小鼠, 本实验396只HBV转基因鼠中, 共检测到HBV DNA整合转基因鼠137只, 占34.6% (137/396), 其中血清中复制HBV DNA的转基因鼠共26只, 占6.6%(26/396). 血清中HBV DNA的存在, 说明HBV基因在小鼠体内有复制, 表明本实验所建立的HBV转基因小鼠可用于观察药物对HBV表达的影响. 然而, 该模型的制备技术要求高, 设备昂贵, 成功率低, 推广应用有一定的难度, 且同人乙型肝炎的复杂表现尚有些差异, 因此在研究药物疗效时需考虑及注意[28-34].
氧化苦参碱是从苦参及苦豆子中提取的生物碱, 国内学者通过氧化苦参碱的基础和临床研究发现氧化苦参碱有抗HBV作用[14,16,20,21], 因此开发和应用我国中草药资源治疗慢性乙型病毒性肝炎, 将有十分重要的社会和经济意义. 体外实验表明[14,20], 氧化苦参碱对HBV DNA转染的细胞株2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有抑制作用, 在一定范围内随着药物浓度增加及作用时间延长, 抑制率逐渐增高, 在同一浓度和同一作用时间下, 都表现为对HBsAg的抑制率高于对HBeAg的抑制率. HBV转基因鼠体内研究发现[21], HBV转基因鼠分别用氧化苦参碱100 mg/ kg、200 mg/ kg、300 mg/ kg 1次/d腹腔注射30 d后, 肝内HBsAg和HBeAg的量与对照组相比均有明显的下降, 在各剂量组之间无显著性差异. 我们的临床研究显示[16]氧化苦参碱可用于治疗慢性乙型病毒性肝炎, 对HBeAg和 HBV DNA阴转率在40.0%左右, 与α-干扰素等转阴率相比较差异不显著, 表明氧化苦参碱是治疗慢性乙型病毒性肝炎比较理想的药物. 我们发现HBV 转基因鼠经氧化苦参碱治疗后, 肝脏组织HBcAg或HBeAg量明显降低, 但氧化苦参碱对肝组织中HBsAg表达影响较少, 这可能与氧化苦参碱治疗疗程较短以及对HBV仅是抑制作用等因素有关. 这些实验结果说明, 氧化苦参碱有抑制HBV复制及抗HBV作用. 至于氧化苦参碱确切的抗HBV机制尚不十分明确, 从不多的研究推测其机制可能为: (1)氧化苦参碱诱导细胞内某种物质(如干扰素等细胞因子)的产生, 从而加强了HBV基因产物的降解; (2)氧化苦参碱的化学结构与嘌呤的结构类似, 其在细胞或体内可干扰HBV核酸的合成. 但其确切抗HBV机制还有待于深入探讨研究.
