修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15
目的: 发现了与乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ(HBV-SPⅠ)结合的未知功能蛋白, 并克隆了他的全长基因.
方法: 以SP Ⅰ核心序列为"诱饵", 应用酵母单杂交技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选, 得到了一个未知基因, 命名为乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1(SBP1).结合生物信息学技术, 应用分子生物学技术, 克隆了SBP 1的基因编码序列.
结果: 经酶切和测序鉴定, 结果正确, 成功克隆了SBP 1的基因编码序列.
结论: SBP 1具有完整的开放读码框, 可能通过与SP Ⅰ的结合发挥生物学作用.
引文著录: 洪源, 成军. 乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子I结合蛋白1的基因克隆化研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 47-50
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004
AIM: To identify the protein which has unknown function binding with the preS1 promoter of hepatitis B virus, and to clone its coding sequence.
METHODS: Yeast one-hybrid system was employed to screen a human liver cDNA library using 3 copies of SP I core sequence as a bait, and one unknown gene was obtained. The coding sequence of the preS1 promoter of hepatitis B virus specific DNA-binding protein 1 (SBP I) was cloned by bioinformatics methods.
RESULTS: The coding sequence of SBP1 was cloned successfully.
CONCLUSION: SBP1 has a complete open reading frame, and biological functions by binding with SP I. The sequence similarity results indicate that the human SBP1 is a new member of transcription factor C/EBP.
- Citation: Hong Y, Cheng J. Cloning of the gene of preS1 promoter of hepatitis B virus specific DNA-binding protein 1. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(1): 47-50
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i1/47.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i1.47
乙型肝炎病毒(HBV)一种严重危害人类健康的致病因子[1]. 他感染人体除引起急慢性乙型肝炎和肝硬化外, 还与肝癌的发生有密切关系[2-10]. HBV属嗜肝DNA病毒, 其基因组为3.2 kb部分双链的环状DNA. 目前在HBV基因组中已发现并鉴定的顺式元件有四个启动子、两个增强子和糖皮质激素应答元件. 其中表面抗原基因含有两个串联的启动子-SP I和SP Ⅱ. SP I (2 219-2 780 nt)的主要作用是调节2.4 kb mRNA的转录, 编码表面抗原大蛋白.研究证实, SP I含有典型TATA盒序列[11], 其上游50 bp处为肝细胞特异性核因子1(hepatocyte nuclear factor 1, HNF1)结合位点[12]. 该结合位点是HBV转录调节的重要组分, 也是HBV嗜肝性的重要原因之一; 另有证据[13]表明这一位点可能还有其他肝特异因子与之结合, 从而调节2.4 kb mRNA的转录. 为了寻找与SP I结合的肝特异性转录作用因子, 进一步探讨SP I的转录调节机制. 我们应用酵母单杂交体系[14], 以3重复的SP I核心序列为"诱饵", 对人肝细胞cDNA文库成功进行了筛选, 得到了一个未知基因, 命名为SBP1. 结合生物信息学方法, 应用分子生物学技术, 克隆了SBP1的基因编码序列.
大肠杆菌DH5α, 肝母细胞瘤细胞系HepG2为本室保存. 人肝细胞cDNA文库购自clontech公司, Taq DNA 聚合酶购自鼎国生物公司, 限制性内切酶购自Takara公司. 质粒DNA提取试剂盒及逆转录扩增试剂盒(Promega公司), 玻璃奶DNA回收试剂盒(博大公司). 引物合成、核苷酸序列测序由上海博亚公司完成.
1.2.1 "饵"载体及酵母报告菌株的构建: 根据HBV ayw全基因组序列以表面抗原前S1区翻译起始点上游90-64 nt设计靶序列5'-AGTTAATCATTACTTCCAAACTAGACA-3'和5'-TGTCTAGTTTGGAAGTAATGATTAACT-3'的串联三聚体, 其片段两端分别加入EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ或EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ限制内切酶识别序列. 将退火的靶序列分别与各自的载体相连接. 转化大肠杆菌感受态细胞, 挑取在Amp平皿上生长的菌落提取质粒, 构建成重组质粒pHISi-sp1和pHISi-1-sp1和pLacZi-sp1, 经酶切及DNA测序鉴定. 将pHISi-sp1和pHISi-1-sp1以Xho I酶切, 参照氯化锂酵母转化方案转化酵母菌株YM4271, 取多个克隆转涂于添加了0-60 mmol/L的3-AT SD/-His平板, 30℃培养7 d. pLacZi-sp1以Nco I酶切线性化后, 转化酵母菌株YM4271, 培养于SD/-Ura缺陷平板, 30 ℃培养7 d.
1.2.2 以酵母报告菌株筛选人肝cDNA文库: 以碱裂解法提取人肝细胞文库质粒. 参照氯化锂酵母转化方案, 转化文库质粒入YMSP1-HIS菌株, 铺板于含30 mmol/L 3-AT的SD/-Leu/-His(亮氨酸和组氨酸)缺陷平板上, 30 ℃培养7 d后, 挑选直径大于2 mm的阳性克隆. 将阳性克隆以玻璃珠法提取酵母质粒. 转化入大肠杆菌JM109感受态细胞, 以碱裂解法提取质粒后转化入YMSP1-LacZ菌株, 铺板于SD/-Ura/-Leu (尿嘧啶和亮氨酸)缺陷平板上.按clontech克隆提取滤膜反应方案验证阳性克隆是否有激活酵母报告株-半乳糖苷酶(-gal)的活性.
1.2.3 阳性cDNA序列的测定及分析: 提取阳性克隆质粒后, 以双脱氧终止法测定DNA序列, 并将所得到的序列与GenBank提供的数据库进行同源性比较, 拼接.
1.2.4 从人肝癌细胞cDNA中扩增SBP1: 肝母细胞瘤细胞系HepG2以完全DMEM培养基培养, 于55 mm培养皿中100%融合后, 提取总RNA, 并进行逆转录扩增. 以该逆转录产物为模板, 设计引物5'-ATG CCA ACA GGC CTG GTC AG-3'和5'-TCT CCC CTG CAT GGC AAG TC-3'(设计长度为470 bp), 进行聚合酶链反应(PCR), 反应产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 并进行测定DNA序列测定.
1.2.5 人SBP1基因和蛋白质序列的生物信息学分析: 利用在线软件, 对于克隆的人SBP1基因序列和蛋白质序列进行生物信息学分析[15].
线性化的pHISi-sp1和pHISi-1-sp1质粒转化入YM427l酵母后, 发现有些克隆在45 mmol/L 3-AT存在下仍能生长, 而有些在30 mmol/L 3-AT存在下不能生长, 说明不同的报告酵母his3渗漏表达水平并不一致. 选取在30 mmol/L 3-AT存在下不能生长的克隆为报告株, 命名为YMSP1-HIS. 线性化后的pLacZi-sp1转化入YM427l酵母, 培养于SD/-Ura缺陷平板. 挑取能在其上生长的克隆作为报告株, 命名为YMSP1-LacZ.
取人肝cDNA文库质粒20 g, 转化入酵母报告株YMSP1-HIS, 铺于20块150 mm含30 mmol/L 3-AT的SD/-Leu/-His缺陷平板上. 30 ℃培养7 d后, 挑选其中直径大于2 mm阳性克隆(共24个), 提取酵母质粒后转化入YMSP1-LacZ酵母报告株, 涂于SD/-Ura/-Leu缺陷平板, 30 ℃培养7 d, 进行克隆提取滤膜反应, 3 h内菌落变蓝者即为双阳性克隆. 从24个单阳性克隆中得到12个双阳性克隆.
对双阳性克隆进行测序, 并根据GenBank数据库进行Blastn同源性搜索和比对, 选择其中1个未知基因进行了拼接, 发现其开放读码框长279 bp, 编码93 aa的蛋白质(图1).
以HepG2细胞系cDNA文库为模板, PCR反应后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 可见长度为470 bp的电泳条带(图2). PCR产物送测序, 结果完全符合SBP1的拼接序列.
将克隆的人SBP1基因序列, 在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn同源序列的比对中, 发现本文克隆的人SBP1基因序列与"clone RP11-6B20 on chromosome 6"基因序列完全同源, 因此, 可以将人SBP1的染色体基因序列定位于6号染色体上. 通过同源序列的比对, 没有发现内含子(intron)序列.
应用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中Swissprot数据库同源蛋白质序列的比对, 发现本文克隆的人SBP1蛋白质序列与鸡的CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein , C/EBP)(图3)的145-183 aa之间的序列高度同源. 这一结构同源性序列的比对提示本文克隆的SBP1蛋白可能是一种转录调节因子, 而且属于C/EBP . 因为人的核苷酸序列的数据库中目前还没有登录的相关序列, 因此可以认为本文克隆的人SBP1基因可能是一种新型的C/EBP , 是这一转录因子蛋白家族的一个新成员.
真核生物的转录起始需要转录因子的参与. 结构上, 这些转录因子通常由一个DNA结合结构域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活结构域组成. 酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子, 研究[16]表明GAL4的DNA结合结构域可结合酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS); 而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用, 提高RNA聚合酶的活性. 在这一过程中, DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用. 酵母单杂交系统正是基于这一理论, 将GAL4的DNA结合功能域置换为文库蛋白, 当他与我们导入的"饵"基因结合后, 就照常可以通过DNA激活结构域激活RNA聚合酶, 从而启动对下游报告基因的转录. 这样, 只要对酵母细胞内报告基因表达的筛选, 我们就可以对DNA与细胞内蛋白质的相互作用进行分析. 应用这一系统, 既可以寻找DNA结合位点, 对DNA结合位点进行分析; 也可以直接从基因文库中得到编码DNA结合蛋白质的核苷酸序列, 无需复杂的蛋白质分离纯化操作. 本实验采用Clontech公司首创的MATCHMAKER酵母单杂交系统[17], 以组氨酸和-gal为报告基因, 进行双阳性筛选. 即首先以his3报告酵母对人肝cDNA文库进行大规模初筛, 从中提取阳性克隆质粒, 在大肠杆菌中扩增后, 再转入LacZ报告酵母, 验证-gal的活性, 从而使假阳性的可能性尽可能降低.
SP I是HBV的一个重要转录元件, 调节HBV表面抗原大蛋白的表达. 对携带HBV DNA的转基因小鼠及感染HBV的黑猩猩模型的研究[18-27]表明, 表面抗原主蛋白可在不同的组织中表达, 而表面抗原大蛋白只在肝内特异发现, 这一结果强烈提示: 表面抗原大蛋白的表达具有肝特异性, SP I在肝特异性表达中起着关键作用[28-38]. Chang et al[39]通过应用瞬时转染分析、体外RNase保护分析等方法, 对这一现象的原因进行了研究, 结果显示, HNF1与SP I的结合可能是主要原因. 将该因子去除后, SP I的转录活性下降了20倍. 同时可能还有其他肝特异因子参与调节[39-40]. 为了寻找新的肝特异结合蛋白, 了解SP I嗜肝性的原因. 我们以3重复的SP I核心序列为"诱饵", 整合入酵母基因组, 构建了酵母报告株; 经加入人肝cDNA文库进行筛选, 得到了12个双阳性克隆, 其中有3个为未知基因. 经用计算机分析、拼接后, 得到了其中一个未知基因的编码序列, 命名为SBP1. 根据这一序列设计引物, 从人肝癌细胞cDNA文库中PCR扩增得到了SBP1基因序列. 反应产物经测序完全符合计算机分析结果, 这表明我们已顺利得到了SBP1编码序列. 这一结果为我们下一步继续研究SP I的转录调控机制及验证SP I和SBP1的体内、外结合作用打下了良好的基础. 但目前新基因的生物学作用和在HBV致病机制中的作用和地位尚不明确, 需要进一步对其进行生物学功能的研究, 以阐明新基因的生物学意义.
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| 2. | 韩 萍, 刘 妍, 成 军, 王 刚, 陆 荫英, 李 克, 李 莉. 截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:141-144. [DOI] |
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| 10. | 洪 源, 成 军, 董 菁, 李 克, 王 琳, 王 刚, 刘 妍. 乙型肝炎病毒HBsAg重组疫苗与表面抗原DNA疫苗诱导H-2b小鼠免疫应答的实验研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:137-140. [DOI] |
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